冬凌草甲素對EC9706細胞增殖、凋亡的影響*

劉俊保，岳靜宇，唐引引

1)南京中醫藥大學第一臨床醫學院中西醫結合科 南京 210029 2)鄭州大學人民醫院中醫科 鄭州 450003 3)河南中醫學院第一附屬醫院國家重點實驗室 鄭州 450000

冬凌草甲素對EC9706細胞增殖、凋亡的影響*

劉俊保1，2)△，岳靜宇3)，唐引引3)

1)南京中醫藥大學第一臨床醫學院中西醫結合科 南京 210029 2)鄭州大學人民醫院中醫科 鄭州 450003 3)河南中醫學院第一附屬醫院國家重點實驗室 鄭州 450000

△男，1966年3月生，博士研究生，主任醫師，研究方向：中西醫結合腫瘤學，E-mail：Liu-371@sohu.com

冬凌草甲素；食管鱗狀細胞癌；EC9706；增殖；凋亡

目的：觀察冬凌草甲素對食管鱗狀細胞癌EC9706細胞增殖、凋亡的影響。方法用MTT法檢測冬凌草甲素對EC9706細胞生長的抑制作用；采用流式細胞儀技術檢測冬凌草甲素對EC9706細胞周期和細胞凋亡的影響，并計算凋亡率；激光共聚焦顯微鏡觀察不同濃度冬凌草甲素作用后EC9706細胞中游離Ca2+熒光強度的變化。結果MTT法顯示冬凌草甲素作用EC9706細胞株后，抑制率隨濃度增高而增高(F=370.600,P<0.001)；流式細胞儀檢測結果顯示，冬凌草甲素作用EC9706細胞48 h后，G1/G0期細胞均顯著增多(F=24.200，P<0.001)；細胞凋亡結果顯示，冬凌草甲素均能明顯誘導EC9706細胞凋亡(P<0.05)，冬凌草甲素40 μmol/L組的作用效果最佳(F=10.214、37.820，P<0.001)。不同濃度冬凌草甲素均升高了EC9706細胞內游離Ca2+熒光強度(F=24.400，P<0.001)。結論冬凌草甲素可抑制EC9706細胞增殖、促進細胞凋亡。

食管癌是消化系統一種常見的惡性腫瘤，全世界每年新增食管癌病例45萬人，我國發病集中在中原太行山區及南方潮汕區[1]。食管癌5 a生存率只有20%左右[2]。中醫藥在抑制癌腫生長、降低腫瘤臨床分期、延長生存期、提高生存質量等方面具有獨特的優勢。冬凌草甲素是我國自行研制的一種從中藥冬凌草中提取的有效成分，它是從唇形香茶屬植物冬凌草中提取的一種以貝殼杉烯為骨架的四環二萜類化合物。該研究通過觀察冬凌草甲素體外誘導人食管鱗狀細胞癌EC9706細胞凋亡的情況，探討其作用機制，為食管癌的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑冬凌草甲素購自鄭州博興生物技術公司，純度98%。胰蛋白酶消化液、四甲基偶氮唑鹽、DMEM購自北京Solarbio公司，無支原體新生牛血清購自杭州天杭生物科技有限公司，細胞DNA含量檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。無鈣臺氏液(NaCl 4.0 g、KCl 0.1 g、NaHCO30.5 g、Na2HPO4·12H2O 0.07 g、MgCl2·6H2O 0.105 g、葡萄糖0.5 g加400 mL超純水攪拌溶解，調pH值為7.4，定容至500 mL，0.22 μm濾膜過濾除菌)4 ℃保存備用。

1.2細胞培養及分組EC9706細胞由河南省生物工程技術研究中心提供，細胞常規培養在含體積分數10%無支原體新生牛血清的DMEM培養基中，于95%相對濕度、37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，2～3 d傳代一次，隔天換液。取對數生長期的EC9706細胞，制成單細胞懸液，按50 000 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔200 μL細胞懸液。將細胞分為空白對照組(用常規培養基培養)和不同終濃度的冬凌草甲素組(用含冬凌草甲素終濃度分別為10、20和40 μmol/L的培養基培養)。

1.3各組細胞增殖的檢測將96孔板置于CO2培養箱中孵育24 h后取出，按1.2分組處理，每組設5個復孔，另設空白調零組。將培養板置于培養箱中繼續孵育24 h后，棄去舊液，每孔加入180 μL RPMI 1640和20 μL MTT溶液繼續孵育4 h，取出后棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，搖床上振蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測每孔OD值，按公式計算細胞增殖抑制率。抑制率=(空白對照組OD值-用藥組OD值)/空白對照組OD值×100%[3]。實驗重復3次。

1.4各組細胞周期和凋亡的測定取對數生長期的EC9706細胞，接種于25 cm2的培養瓶內，每瓶5 mL，置于CO2培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后棄去瓶內舊液，按1.2分組處理，分別培養48、72 h后，棄去瓶內舊液，用胰蛋白酶消化并收集細胞，用PBS洗滌2次(離心1 000 r/min，5 min/次)，收集并調整細胞密度為1×106mL-1，按照細胞周期和凋亡檢測試劑盒說明書步驟操作，1 h內上流式細胞儀檢測。

1.5各組細胞胞漿中游離鈣離子([Ca2+]i)的激光共聚焦顯微鏡檢測將鈣熒光探針Fluo-3/AM(美國AAT公司)用DMSO配成5 mmol/L液體，促溶劑F-127(美國AAT公司)溶于DMSO，配成200 g/L的液體；分別將上述兩液體加入到12.5 mL RPMI 1640液中，-20 ℃避光保存備用。細胞培養48 h后終止培養，用無鈣臺氏液洗滌3次，每次1 mL，取200 μL Fluo-3/AM與F-127混合液，正對微型皿的中央圓形凹槽加入，37 ℃避光孵育30 min，吸去負載液，用無鈣臺氏液洗滌3次，于凹槽中加入200 μL無鈣臺氏液，于激光共聚焦顯微鏡(美國Meri-dian公司)上檢測[Ca2+]i。將負載好熒光探針的細胞置于載物臺上，調焦距使圖像達到最清晰，選取外形較規整的細胞進行觀察。先用氬離子激光慢速預掃描，調至視野清晰后正式掃描。實驗過程中始終保持掃描參數一致。參照文獻[4]，每組選取6～8個視野，每個視野選取5個細胞。利用激光共聚焦顯微鏡所配備的計算與圖像軟件(FV10-ASW 1.6 Viewer)計算熒光強度(fluorecence intensity，FI)平均值，FI越大，[Ca2+]i越高。

1.6統計學處理采用SPSS 16.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較冬凌草甲素對EC9706細胞增殖、細胞周期及細胞胞漿中[Ca2+]i的影響，應用4×2析因設計的方差分析比較不同培養時間各組冬凌草甲素對EC9706細胞早、晚期凋亡的影響，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1冬凌草甲素對EC9706細胞增殖的影響冬凌草甲素組在加藥后24 h，倒置顯微鏡下觀察(圖1)，可見大部分細胞由梭形變為不規則形，細胞間接觸松散，細胞匯合率低，出現部分漂浮細胞，部分細胞膜皺縮發泡，少量細胞固縮呈圓形或卵圓形且透亮，個別細胞變小。10、20和40 μmol/L的冬凌草甲素對EC9706細胞的增殖抑制率分別為(19.45±2.34)%、(41.38±3.32)%和(78.83±4.99)%，差異有統計學意義(F=370.600，P<0.001)。

2.2不同濃度冬凌草甲素對EC9706細胞周期和凋亡的影響見表1、2。

2.3各組細胞胞漿中[Ca2+]i的檢測結果藥物作用2 h后，空白對照組FI為553.83±133.67，10、20和40 μmol/L冬凌草甲素組的FI分別為2 090.241±296.24、2 354.60±511.78和2 680.22±276.59，差異有統計學意義(F=24.400，P<0.001)。用藥組細胞FI明顯高于對照組，說明不同濃度冬凌草甲素作用后EC9706細胞內[Ca2+]i明顯上升。

圖1 不同濃度冬凌草甲素對EC9706細胞增殖的影響(×200)

表1冬凌草甲素作用48h后對EC9706細胞周期的影響 %

組別nG1/G0SG2/M空白對照組351．62±0．4137．86±0．6110．76±0．76冬凌草甲素10μmol/L組361．77±4．19?#32．73±2．21#5．51±3．04冬凌草甲素20μmol/L組361．90±2．93?#32．21±1．34#5．89±1．99#冬凌草甲素40μmol/L組371．40±3．65?24．16±1．49?4．44±1．48?F24．20023．090111．200P<0．001<0．001<0．001

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與冬凌草甲素40 μmol/L組比較，P<0.05。

表2 冬凌草甲素對EC9706細胞凋亡的影響

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與冬凌草甲素40 μmol/L組比較，P<0.05。

3 討論

目前，食管癌病因不明，癌變的分子機制不清，治療以手術、放療、化療、生物治療為主，缺乏有效的預防措施和特異性的診治指標與方法，因而發病率和病死率仍未得到有效控制。中醫藥毒副作用較小，單用中藥或聯合放、化療等，在改善吞咽困難、減輕癌痛、提高免疫能力、縮小瘤體、改善全身狀況、減少復發和轉移、提高生存質量和5 a生存率方面療效確切，并且可為放、化療減毒增效。冬凌草甲素抑制細胞增殖與阻滯細胞周期有關[5]。

該實驗結果顯示10～40 μmol/L冬凌草甲素對于體外培養的EC9706細胞具有抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡的能力，且其促進凋亡的能力具有濃度的依賴性，這與冬凌草甲素誘導其他腫瘤細胞的凋亡結論一致[6]。流式細胞檢測儀的細胞周期結果證明不同濃度冬凌草甲素均能夠使EC9706細胞阻滯于G1或G2/M期，從而使食管癌細胞生長受到抑制，其機制可能為冬凌草甲素參與調控胞膜鈣通道的運輸系統或啟動細胞凋亡的信號傳導通路等。有研究[6]表明：冬凌草甲素誘導細胞凋亡時，發現在細胞凋亡早期，線粒體出現形態改變，如線粒體增生、腫脹等。冬凌草能抑制DNA、RNA的合成，其作用靶點是DNA聚合酶[7]；其發揮抗腫瘤活性的作用機制可能是作用于凋亡可控因素，如降低bcl-2的表達水平，激活Caspase途徑等誘導細胞發生凋亡[8]；端粒酶與細胞凋亡密切相關, 還可以增加對凋亡細胞的吞噬[9]，并影響細胞的信號傳導[10]。

總之，冬凌草甲素作為我國自行研制的中藥抗癌單體，在細胞、動物實驗中均發現有抗腫瘤的作用，且在臨床上試用于食管癌、胃癌等治療顯示出較好的結果，值得今后作進一步深入的研究。

[1]李曉昀,蘇敏,黃海花,等.潮汕人與廣府、客家人母系遺傳背景差異的分析[J].西安交通大學學報:醫學版,2010,31(6):664

[2]伍玥,董金成,戶彥龍,等.手術切除淋巴結數和轉移淋巴結數對食管鱗狀細胞癌患者生存期的影響[J].鄭州大學學報:醫學版,2013,48(2):152

[3]姚國棟.bcl-2,bax基因與胃癌[J].中國腫瘤,2003,12(11):656

[4]Kai L,Wang ZF,Shi YL,et al.Opioid receptor antagonists increase [Ca2+]i in rat arterial smooth muscle cells in hemorrhagic shock[J].Acta Pharmacol Sin,2004,25(3):395

[5]郝亞寧,羅媛媛,張梅,等.冬凌草甲素協同馬法蘭對人骨髓瘤RPMI-8226細胞增殖和凋亡的影響[J].吉林大學學報:醫學版,2013,39(4):699

[6]謝曉原,陳俊輝,王少彬,等.冬凌草甲素誘導人食管癌SHEE細胞凋亡及其線粒體改變[J].現代腫瘤醫學,2008,16(6):907

[7]楊勝利,張巧,宋愛云,等.冬凌草甲素對大鼠肺及肝原代細胞非程序DNA合成的影響[J].河南醫科大學學報,2001,36(4):415

[8]崔玉,趙斌,韓培立,等.食管鱗癌中PTEN和Caspase-3的表達及臨床意義[J].西安交通大學學報:醫學版,2006,27(4):356

[9]胡穎軍,張進朝.冬凌草甲素現代藥理研究進展[J].光明中醫,2011,26(3):618

[10]李翔,葉利洪,李繼承.冬凌草甲素抗腫瘤活性及其機制[J].細胞生物學雜志,2009,31(3):313

(2013-05-11 收稿 責任編輯 趙秋民)

Influence of oridonin on EC9706 cell proliferation and apoptosis

LIUJunbao1，2),YUEJingyu3),TANGYinyin3)

1)SubjectofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,theFirstClinicalCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029 2)DepartmentofTraditionalChineseMedicine,thePeople’sHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003 3)StateKeyLaboratory,theFirstTeachingHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000

oridonin; esophageal squamous cell carcinoma; EC9706; proliferation;apoptosis

Aim: To study the influence of oridonin on esophageal squamous cell carcinoma EC9706 cell proliferation and apoptosis in vitro. Methods: MTT assay was used to detect the inhibition effect of oridonin on the growth of EC9706; flow cytometry was applied to detect the impact of oridonin on cell cycle and apoptosis of EC9706, and calculated the apoptosis rate of cells; change of Ca2+fluorescence intensity of EC9706 affected by different concentrations of oridonin was observed by laser scanning confocal microscope. Results: MTT assay showed that the inhibition rate in the experiment group increased with the rising of concentration(F=370.600,P<0.001) after oridonin acting on EC9706; results of cell cycle detected by flow cytometry showed that the number of cell in G0and G1stage increased notably after oridonin acting on EC9706 for 48 hour respectively(F=24.200，P<0.001); results of apoptosis showed that oridonin could obviously induce the apoptosis of EC9706(P<0.05), and the effect was the best when the oridonin concentration was 40 μmol/L(F=10.214，37.820，P<0.001). Different concentrations of oridonin could increase Ca2+fluorescence intensity of EC9706, and the difference was significant (F=24.400，P<0.001). Conclusion: oridonin can improve the inhibition effects on proliferation and apoptosis of EC9706 cell.

*河南省衛生廳5451項目 2011077

R735.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.003