凍存對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞免疫表型及細(xì)胞內(nèi)因子表達(dá)的影響*

王 菲，王麗萍, 張 震，岳冬麗2，，段秀芳2，，張 斌，張 毅

1)鄭州大學(xué)生物工程系 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 4)美國西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院 芝加哥60611 5)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 鄭州 450052

凍存對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞免疫表型及細(xì)胞內(nèi)因子表達(dá)的影響*

王 菲1，2)，王麗萍3), 張 震1，2)，岳冬麗2，3)，段秀芳2，3)，張 斌2,4)，張 毅1，2，3，5)#

1)鄭州大學(xué)生物工程系 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 4)美國西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院 芝加哥60611 5)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 鄭州 450052

#通訊作者，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向：腫瘤免疫學(xué)、腫瘤干細(xì)胞和生物細(xì)胞治療，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞;細(xì)胞內(nèi)因子;凍存;免疫表型

目的：探討凍存對外周血來源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)免疫表型及細(xì)胞內(nèi)因子表達(dá)的影響。方法采集10例癌癥患者的外周血，采用Ficoll兩步法分離外周血單個核細(xì)胞，用細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)得CIK。收集凍存3個月后復(fù)蘇4、24、72 h的CIK,采用流式細(xì)胞術(shù)及胞內(nèi)染色法檢測細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B及干擾素-γ的表達(dá)水平，采用AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞活性。以未凍存的新鮮CIK作對照。結(jié)果凍存前及復(fù)蘇4 h后CIK顆粒酶B及干擾素-γ表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.029、0.237，P>0.05)。凍存前及復(fù)蘇4、24、72 h后CIK穿孔素表達(dá)水平分別為(35.97±7.12)%、(10.00±6.04)%、(17.60±3.92)%和(35.20±6.23)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.480，P<0.001)，凍存后CIK穿孔素表達(dá)水平顯著降低，隨著復(fù)蘇時間的延長， 穿孔素表達(dá)水平逐漸恢復(fù)正常。復(fù)蘇4、24、72 h后CIK活細(xì)胞比例逐漸增多(P<0.05)，復(fù)蘇72 h后活細(xì)胞比例接近100%，細(xì)胞活性恢復(fù)正常。結(jié)論凍存可能使CIK細(xì)胞亞型發(fā)生改變。

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cell, CIK)是一群異質(zhì)性免疫活性細(xì)胞，具有較強(qiáng)的抗腫瘤能力[1]。CIK既能通過釋放大量的炎性分子，如白介素(interleukin，IL)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而間接殺傷腫瘤，又能通過釋放顆粒酶B(granzyme-B)、穿孔素(perforin)等毒性顆粒，直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解[2]。凍存是貯藏有活性的淋巴細(xì)胞并應(yīng)用于后期實驗的一種常用方法，有關(guān)凍存對細(xì)胞參數(shù)的影響已有過研究，包括細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞表面標(biāo)志物等[3-4]，但有關(guān)凍存對CIK穿孔素、顆粒酶B、IFN-γ表達(dá)的影響報道甚少。作者收集了10例癌癥患者的外周血,分離出單個核細(xì)胞并誘導(dǎo)為CIK,觀察凍存前后CIK免疫表型、細(xì)胞活性，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)因子穿孔素、顆粒酶B及IFN-γ表達(dá)水平的變化，為CIK的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源外周血標(biāo)本來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為癌癥的10例患者，標(biāo)本采集均征得患者同意并簽訂知情同意書。

1.2試劑和儀器流式細(xì)胞儀FASCanto Ⅱ購自美國 BD公司，各種免疫熒光抗體購自美國BD Pharmingen 公司，抗CD3單克隆抗體購自以色列Prospec-tang公司，Hyclone RPMI 1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，胎牛血清購自Gibco公司,重組人IL-2購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，重組人IFN-γ購自上海凱茂藥業(yè)有限公司，F(xiàn)icoll-Plaque淋巴細(xì)胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司，AnnexinV/PI試劑盒購自北京碧云天公司，佛波酯(PMA)和離子霉素購自美國Sigma 公司。

1.3外周血CIK的獲取無菌條件下采集外周血30～40 mL(肝素鈉抗凝)，加入Ficoll-Plaque淋巴細(xì)胞分離液并進(jìn)行密度梯度離心(2 500 r/min，25 min)，提取白膜層，PBS洗滌后重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106mL-1，加入IFN-γ(1 000 U/mL)置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后加入抗CD3單克隆抗體(100 mg/L)、IL-2(2 000 U/mL)繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d分瓶一次并補(bǔ)加完全培養(yǎng)液及IL-2,培養(yǎng)13 d后，CIK成熟。將CIK分為兩部分，一部分直接用于指標(biāo)測定，另一部分經(jīng)凍存、復(fù)蘇后再進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.4CIK的凍存和復(fù)蘇凍存：取誘導(dǎo)成熟的CIK，計數(shù)后1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入凍存液[RPMI 1640小牛血清二甲基亞砜(體積比)=541],首先于4 ℃冰箱中放置1 h,然后-20 ℃冰箱中放置2 h,轉(zhuǎn)至-80 ℃低溫冰箱放置3個月。復(fù)蘇：將凍存的CIK從-80 ℃低溫冰箱中取出后放入37 ℃水浴鍋內(nèi)迅速融化，用完全培養(yǎng)基洗1遍，重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5CIK免疫表型和細(xì)胞內(nèi)因子的檢測取10例患者新鮮培養(yǎng)的外周血CIK(凍存前)或復(fù)蘇4、24和72 h的CIK，重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入PMA 50 μg/L和離子霉素750 μg/L,同時加入阻斷劑布雷菲德菌素A(稀釋1 000倍)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4～5 h。首先進(jìn)行免疫表型檢測，分別加入PE-CY7-CD3抗體、percp-CD8抗體、PE-CY7-CD4抗體200 μL避光15 min，多聚甲醛固定20 min。再用破膜劑破膜，將破膜后的CIK分別與PE-granzyme-B抗體、FITC-perforin抗體、APC-IFN-γ抗體共孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6CIK活性的檢測分別取5例患者復(fù)蘇4、24和72 h的CIK，采用AnnexinV/PI雙染試劑盒染色，然后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活性。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；凍存前及復(fù)蘇后CIK免疫表型、IFN-γ和顆粒酶B表達(dá)水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗，穿孔素和細(xì)胞活性的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗；檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1凍存前及復(fù)蘇4h后CIK免疫表型和IFN-γ、顆粒酶B表達(dá)水平的比較凍存前及復(fù)蘇4 h后， CD8+、CD4+T細(xì)胞比例及細(xì)胞內(nèi)因子IFN-γ、顆粒酶-B的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2凍存前后CD8+T細(xì)胞穿孔素表達(dá)水平的變化凍存前及復(fù)蘇4、24和72 h后,CD8+T細(xì)胞穿孔素表達(dá)水平分別為(35.97±7.12)%、(10.00±6.04)%、(17.60±3.92)%和(35.20±6.23)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.480,P<0.001)。復(fù)蘇72 h后細(xì)胞穿孔素表達(dá)水平恢復(fù)至凍存前水平。

2.3復(fù)蘇后細(xì)胞活性的變化細(xì)胞活性檢測結(jié)果見表2。復(fù)蘇4 h后，死細(xì)胞比例較高；隨著復(fù)蘇時間的增加，活細(xì)胞比例逐漸增大，復(fù)蘇72 h后活細(xì)胞比例接近100%，細(xì)胞活性恢復(fù)正常。

表1 凍存前及復(fù)蘇4 h后CIK免疫表型和IFN-γ、顆粒酶B表達(dá)水平的比較 %

表2 復(fù)蘇后CIK細(xì)胞活性檢測結(jié)果 %

3 討論

CIK細(xì)胞抗腫瘤機(jī)制主要通過釋放細(xì)胞內(nèi)因子激活機(jī)體免疫系統(tǒng)或直接裂解靶細(xì)胞實現(xiàn)。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇是實驗室處理細(xì)胞的常規(guī)方法，關(guān)于凍存對細(xì)胞功能的影響已有大量文獻(xiàn)報道[5-6]。Francois等[7]將凍存的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)與T細(xì)胞共孵育，檢測T細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果提示，凍存前MSC通過活化IDO(indoleamine2,3-dioxygenase)信號通路而抑制T細(xì)胞增殖，但是凍存后的MSC該抑制功能消失，他們推測主要原因為凍存使熱激活蛋白活化進(jìn)而下調(diào)IFN-γ對IDO的誘導(dǎo)表達(dá)；細(xì)胞復(fù)蘇24 h后，MSC的功能恢復(fù)。Sallusto等[8]發(fā)現(xiàn)凍存過程中細(xì)胞發(fā)生內(nèi)化作用，CD8+T細(xì)胞表面分子CD62L表達(dá)下調(diào)，因此初始性T細(xì)胞(CD45RA+CD62L+)和中心記憶性T細(xì)胞(CD45RO+CD62L+)減少，而效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞(CD45RA+CD62L-、CD45RO+CD62L-)增加。

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)因子[9]是通過體外多克隆激活劑(如PMA和離子霉素)或特定的抗原激活細(xì)胞，同時加入莫能霉素或布霉菲德菌素A阻斷胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，抑制細(xì)胞因子釋放到細(xì)胞外，使細(xì)胞因子在胞質(zhì)內(nèi)蓄積，經(jīng)多聚甲醛固定和皂角苷破膜增加細(xì)胞膜的通透性后，加入相應(yīng)抗體，用流式細(xì)胞儀檢測不同抗體標(biāo)記的細(xì)胞亞群。

該研究中作者觀察了凍存前后CIK細(xì)胞內(nèi)因子穿孔素、IFN-γ、顆粒酶B表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，凍存后CIK穿孔素表達(dá)水平顯著降低，但隨著復(fù)蘇時間的延長，又逐漸恢復(fù)；而IFN-γ、顆粒酶B表達(dá)水平無明顯變化。其他實驗室已經(jīng)研究過細(xì)胞毒殺傷性顆粒分泌細(xì)胞，包括CCR7+CD45RO+中心記憶性T細(xì)胞，CCR7-CD45RA-效應(yīng)性T細(xì)胞，CCR7-CD45RA+效應(yīng)性T細(xì)胞。上述細(xì)胞均能分泌IFN-γ，而穿孔素和顆粒酶主要由CCR7-CD45RA+效應(yīng)性T細(xì)胞分泌[10-11]。不同亞型的T細(xì)胞可能對溫度的敏感性不同，凋亡的可能性也不同。另外作者還發(fā)現(xiàn)在復(fù)蘇一定時間后隨著CIK活性的增加，穿孔素的表達(dá)水平也恢復(fù)，細(xì)胞可能由靜息狀態(tài)逐漸活化，細(xì)胞亞型也隨著改變[12]。因此在下一步研究中作者將分析凍存對不同亞型細(xì)胞(CCR7/CD45RA/CD45RO)的影響，并探討其分子機(jī)制。

[1]Wang Y,Bo J,Dai HR,et al.CIK cells from recurrent or refractory AML patients can be efficiently expanded in vitro and used for reduction of leukemic blasts in vivo[J].Exp Hematol,2013,41(3):241

[2]Krause DL,Wagner JK,Wildenauer A,et al.Intracellular monocytic cytokine levels in schizophrenia show an alteration of IL-6[J].Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci,2012,262(5):393

[3]Radke L,López Hemmerling DA,Lubitz A,et al.Induced cytokine response of human PMBC-cultures: correlation of gene expression and secretion profiling and the effect of cryopreservation[J].Cell Immunol,2012,272(2):144

[4]Costantini A,Mancini S,Giuliodoro S,et al.Effects of cryopreservation on lymphocyte immunophenotype and function[J].J Immunol Methods,2003,278(1/2):145

[5]Hayden H,Friedl J,Dettke M,et al.Cryopreservation of monocytes is superior to cryopreservation of immature or semi-mature dendritic cells for dendritic cell-based immunotherapy[J].J Immunother,2009,32(6):638

[6]Kotsakis A,Harasymczuk M,Schilling B,et al.Myeloid-derived suppressor cell measurements in fresh and cryopreserved blood samples[J].J Immunol Methods,2012,381(1/2):14

[7]Francois M,Copland IB,Yuan S,et al.Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-γ licensing[J].Cytotherapy,2012,14(2):147

[8]Sallusto F,Lenig D,F?rster R,et al.Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions[J].Nature,1999,401(6754):708

[9]Weren A,Bonnekoh B,Schraven B,et al.A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes[J].J Immunol Methods,2004,289(1/2):17

[10]Sallusto F,Geginat J,Lanzavecchia A.Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance[J].Annu Rev Immunol,2004,22:745

[11]Hamann D,Baars PA,Rep MH,et al.Phenotypic and functional separation of memory and effector human CD8+T cells[J].J Exp Med,1997,186(9):1407

[12]Rock MT,Yoder SM,Wright PF,et al.Differential regulation of granzyme and perforin in effector and memory T cells following smallpox immunization[J].J Immunol,2005,174(6):3757

(2013-05-22 收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

Effects of cryopreservation on CIK immunophenotype and intracellular cytokine expression

WANGFei1,2),WANGLiping3),ZHANGZhen1，2),YUEDongli2，3),DUANXiufang2，3),ZHANGBin2，4),ZHANGYi1,2,3,5)

1)DepartmentofBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 4)MedicalSchool,NorthwesternUniversity,Chicago60611,USA5)InstituteofClinical-MedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

cytokine-induced killer cell;intracellular cytokine;cryopreservation; immunophenotype

Aim: To explore the effects of cryopreservation on cytokine-induced killer cell(CIK) immunophenotype and intracellular cytokine expression. Methods: Peripheral blood mononuclear cells from ten patients with cancer were isolated by Ficoll-Plaque density gradients and CIKs were obtained by incubating with appropriate cytokines. The secretion levels of perforin, granzyme-B and interferon-γ in CIK cryopreserved for 3 months and recovered for 4,24,and 72 h were detected by flow cytometry assay and intracellular staining, and cellular activity were detected by PI and AnnexinV staining. The fresh CIKs were the control. Results: There was no significant difference in the levels of granzyme-B or interferon-γ between fresh CIK and those recovered for 4 h(t=1.029，0.237，P>0.05). However, the level of perforin in fresh CIK, those recovered for 4,24,and 72 h cells were (35.97±7.12)%,(10.00±6.04)%,(17.60±3.92)% and (35.20±6.23)%, and there was significant difference(F=47.480，P<0.001);the expression level in perforin cryopreserved CIK decreased and gradually reached to the normal level with time.Cellular activity of CIK also recovered gradually(P<0.05).Conclusion: Cryopreservation might change the cell subtypes of CIK.

*國家自然科學(xué)基金資助項目 81171986，81271815；衛(wèi)生部科研攻關(guān)基金項目 20110110001；河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究基金項目 112300410153，122300410155；河南省科技廳科技創(chuàng)新人才計劃項目 124200510006；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)創(chuàng)新團(tuán)隊基金項目

R392-33

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.004