SYAP1真核表達載體的構建及蛋白表達定位*

郝慧鑫，菅輝玲，朱美意，黃 瑾，羅 星#

1)石河子大學醫學院生物化學教研室 石河子 832000 2)石河子大學第一附屬醫院急診外科 石河子 832000

SYAP1真核表達載體的構建及蛋白表達定位*

郝慧鑫1)，菅輝玲1)，朱美意2)，黃 瑾1)，羅 星1)#

1)石河子大學醫學院生物化學教研室 石河子 832000 2)石河子大學第一附屬醫院急診外科 石河子 832000

#通訊作者，男，1973年10月生，博士，副教授，研究方向：蛋白質的功能與疾病，E-mail:Luoxingxing@126.com

突觸相關蛋白1；亞細胞定位；真核表達載體

目的：構建pcDNA3.1(-)-Myc-突觸相關蛋白1(SYAP1)真核表達載體。方法合成SYAP1基因序列，加入Myc標簽序列、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點，并與線性化pcDNA3.1(-)連接，得重組質粒pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1。重組質粒經菌落PCR、酶切及測序鑒定正確后，脂質體轉染HEK293細胞，采用Western blot和間接免疫熒光法檢測轉染細胞中SYAP1蛋白的表達及定位情況。結果Myc-SYAP1成功插入pcDNA3.1(-)載體，SYAP1蛋白成功表達且定位于胞漿。結論pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1載體構建成功。

各種神經損傷和神經系統退行性病變一直是困擾人類的一大類疾病,其預后主要取決于神經受損后的再生修復能力。在眾多參與神經發育分化的蛋白質分子中，突觸相關蛋白(synapse-associated protein,SYAP)能促進突起的生長，與神經系統可塑性密切相關[1]。SYAP1蛋白作為SYAP家族中的一員，對于提高受損神經的修復能力，改善神經損傷和神經系統疾病患者的生存質量，具有非常好的應用前景。研究[2]表明：除心臟、骨骼肌、脾臟和睪丸外，其他組織均能表達SYAP1，且SYAP1于腦組織中高表達，提示SYAP1在神經系統中發揮著重要作用。目前對SYAP1的研究大多集中在結構分析方面，鮮見有關其功能的報道。作者旨在構建SYAP1真核表達載體，為深入研究SYAP1蛋白在神經再生與神經系統可塑過程中的功能奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1主要試劑和細胞限制性內切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)；PCR試劑盒、質粒提取試劑盒、Myc單克隆抗體和β-actin單克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；ECL化學發光試劑盒(Thermo公司)；DMEM培養基和抗鼠熒光二抗(Sigma公司)；PVDF膜(Whatman公司)。大腸桿菌DH5α、pcDNA3.1(-)空質粒由石河子大學醫學院生物化學教研室保存；HEK293細胞購自上海中科院細胞研究所。

1.2目的基因的合成依據GenBank收錄的人SYAP1基因序列(登錄號：NM_032796.3)，全基因合成SYAP1序列[3-6]，并在5’端引入EcoR Ⅰ酶切位點，3’端引入Myc(5’-CAAAAACTCATCTCAGAAGAG GATCTGTGA-3’)標簽序列和Hind Ⅲ酶切位點。

1.3PCR引物的設計與合成根據SYAP1基因序列在靠近5’端設計一對特異引物：上游5’-CCGCTCGAGACCTTAAGTCCGTCTTCACAC-3’，下游5’-ATTTGCGGCCGCTCAAGGCTCTTTTATGTC-3’，擴增片段大小為280 bp，由上海生工生物工程服務有限公司合成。

1.4重組質粒pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1的構建目的基因片段經EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切、膠回收后，與雙酶切的質粒pcDNA3.1(-)經T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，將PCR初步鑒定為陽性的菌落于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜，抽提質粒，用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切進行鑒定。PCR產物送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.5細胞內SYAP1蛋白表達的檢測應用Western blot方法。采用含體積分數10% 胎牛血清的DMEM 培養基培養HEK293細胞，置體積分數5%CO2、37 ℃溫箱中，待細胞融合度達到60%～70%時，采用脂質體LipofectamineTM2000轉染重組質粒。48 h后收取總蛋白，經SDS-PAGE分析，電轉移至PVDF膜。50 g/L脫脂奶粉常溫封閉30 min，加入稀釋1 000倍的Myc一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜4次，加入HRP標記的二抗(按150 000稀釋)，常溫孵育30 min。TBST洗膜4次，ECL發光試劑盒顯影。以目的蛋白和內參β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6SYAP1蛋白的細胞定位應用間接免疫熒光分析方法。將HEK293細胞轉染重組質粒，具體方案同1.5。轉染24 h后制備爬片，24 h后取出爬片，PBS洗滌，40 g/L多聚甲醛溶液固定，室溫靜置20 min。牛血清白蛋白室溫封閉30 min。用稀釋200倍的Myc一抗孵育，4 ℃過夜，PBS洗滌；加二抗于37 ℃避光孵育2 h，PBS洗滌；滴加緩沖甘油，覆以蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1重組質粒的PCR鑒定陽性菌落經PCR鑒定，可見到280 bp大小的片段，與預期目的片段的大小相符(圖1)。

圖1 重組質粒的菌落PCR電泳圖

2.2重組質粒pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1的酶切鑒定對pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1進行雙酶切，得到5 600 bp的載體片段和1 101 bp的目的片段，與預期相符(圖2)。測序結果證實插入正確。

圖2 重組質粒的雙酶切電泳圖

2.3重組質粒轉染細胞SYAP1蛋白的表達轉染pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1的HEK293細胞可見目的條帶(圖3)。

圖3 SYAP1蛋白表達的Western blot檢測結果

2.4SYAP1蛋白的細胞定位間接免疫熒光結果顯示SYAP1蛋白表達于胞漿(圖4)。

圖4 SYAP1蛋白的亞細胞定位(×400)

3 討論

突觸是神經元之間傳遞電、化學物質的結構，其終末成分包含了完整的突觸前末梢、突觸后膜以及突觸后致密物，集中了全部的突觸相關蛋白，承擔著儲存、釋放、再提取神經遞質和維持突觸可塑性的重要作用[7]。突觸可塑性是學習記憶的生物學基礎。研究[8]表明：突觸結構和功能的改變在神經系統疾病發病機制中的作用越來越明顯，尤其是在認知功能損害中的作用。SYAP1蛋白對于突觸傳遞及其相關調節都極為重要，例如在Alzheimer病中突觸結構、功能與神經元的功能、活性有關，且突觸損傷的發生早于神經元死亡丟失[9-10]。為了進一步闡明神經系統疾病相關突觸傳遞和突觸可塑性的分子機制，SYAP1的研究正逐漸成為一個亮點。

課題組酵母雙雜交[11]結果顯示：SYAP1與神經營養因子Neuritin有相互作用，推測：Neuritin可能作為上游因子，通過與SYAP1相互作用，促進突觸生長發育，維持神經系統可塑性；也可能是作為SYAP1的正向調節因子或修飾分子，通過與SYAP1的相互作用，促進突觸相關蛋白向軸突終末轉運，而產生相應的生物效應。SYAP1在大多數成人的組織中能夠被檢測到，并且在人肝癌組織中表達下調。國內未見針對SYAP1蛋白的更深入的相關功能和機制研究。SYAP1蛋白為一相對分子質量40 000的蛋白，為了取得滿意的實驗結果，作者在C端帶了Myc標簽序列，Myc蛋白的相對分子質量為1100。此舉措將有助于將來的蛋白純化，同時防止表達產物的降解。此次重組質粒pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1的成功構建為后續SYAP1蛋白的功能研究奠定了實驗基礎。

[1]Bai F,Witzmann F.Synapyosome proteomics[J].Subcell Biochem,2007,43:77

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(2013-06-21 收稿 責任編輯 李沛寰)

Construction of eukaryotic expression vector of SYAP1 and intracellular location

HAOHuixin1)，JIANHuiling1)，ZHUMeiyi2)，HUANGJin1)，LUOXing1)

1)DepartmentofBiochemistry,MedicalSchool，ShiheziUniversity,Shihezi832000 2)DepartmentofEmergencySurgery,theFirstAffiliatedHospital,ShiheziUniversity,Shihezi832000

synapse-associated protein 1;subcellular location;eukaryotic expression vector

Aim: To construct eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1. Methods: SYAP1 sequence was synthesized, joined with Myc-tag sequence andEcoR Ⅰ,Hind Ⅲ restriction sites, and then connected with linearized pcDNA3.1(-). After the identification by the results of colony PCR, restriction analysis and sequencing,the plasmid was transfected into HEK293 cells by lipid transfection, Western blot and indirect immunofluorescence were applied to observe the expression level and position of SYAP1 protein in cells. Results: The results of colony PCR, sequencing and restriction enzyme digestion showed that the target nucleotide sequences were successfully inserted into the expected sites of the vector. Western blot showed that SYAP1 protein was successfully expressed in transfected HEK293 cells,and lind indirect immunofluorescence result showed that SYAP1 protein located in cytoplasm. Conclusion: Recombinant vector of pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1 has been successfully constructed.

*國家自然科學基金項目 31160182；兵團國際科技合作計劃項目 2011BC009

R651.3

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.006