吡格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC表達的影響*

杜芳宇，劉劍波

鄭州大學第二附屬醫院呼吸內科 鄭州 450014

吡格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC表達的影響*

杜芳宇，劉劍波#

鄭州大學第二附屬醫院呼吸內科 鄭州 450014

#通訊作者，男,1964年2月生,博士,教授,主任醫師,研究方向：哮喘的發病機制和防治，E-mail:jbliuzz@yahoo.com.cn

A型γ-氨基丁酸受體α亞單位; MUC5AC; 吡格列酮; 哮喘；小鼠

目的：觀察吡格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC表達的影響。方法30只成年BALB/C小鼠隨機分為3組，每組10只。哮喘組和吡格列酮干預組以卵白蛋白(OVA)致敏、激發制作哮喘小鼠模型，吡格列酮干預組于每次激發前30 min霧化吸入吡格列酮5×10-5mol/L，對照組以生理鹽水代替OVA處理。末次激發后24 h處死小鼠，取肺組織行HE染色觀察氣道病理學表現，采用免疫組化SP法、RT-RCR法檢測肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白和mRNA的表達。結果哮喘組小鼠氣道黏膜下充血水腫，黏膜層增厚，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎性細胞浸潤；吡格列酮干預組上述表現較哮喘組減輕。哮喘組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白和mRNA的表達水平均較對照組高，吡格列酮干預組較哮喘組降低，但仍高于對照組(P均<0.05)。結論吡格列酮可能通過下調GABAARα的表達在哮喘氣道黏液過度分泌中起治療作用。

炎癥、重構及黏液高分泌是支氣管哮喘的重要病理表現。吡格列酮是過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPARγ)激動劑。研究[1-2]顯示PPARγ激動劑除可明顯抑制促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的產生外，還可抑制哮喘模型小鼠肺嗜酸粒細胞及氣道高反應性。A型γ-氨基丁酸受體(γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR)屬受體門控離子受體超家族，α亞單位在GABAAR復合物的組裝和功能中可能起主要作用。近來研究[3]發現GABA合成酶和GABAAR在氣道上皮細胞表達,而且哮喘時表達增強,伴有黏液過度分泌。MUC5AC由氣道杯狀細胞分泌，反映了氣道黏液分泌的情況。該實驗旨在研究吡格列酮干預后哮喘模型小鼠肺組織GABAARα和MUC5AC表達水平的變化,探討哮喘時氣道黏液過度分泌的發生機制,并為哮喘的早期干預治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器卵白蛋白(OVA，Sigma公司)，鹽酸吡格列酮(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司惠贈)，小鼠抗MUC5AC單克隆抗體、小鼠抗GABAARα單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Trizol試劑、RT-PCR 試劑盒(Transgene公司)，超聲霧化器(上海魚躍醫療設備有限公司)，德國Lecia顯微照像系統，PCR擴增儀(Eppendorf公司)，D-140圖像記錄分析系統(大連競邁生物科技有限公司)。

1.2實驗分組及處理6～8周齡清潔級BALB/C小鼠30只，體重18～22 g，購自河南省實驗動物中心。按隨機數字表法分為3組：對照組、哮喘組和吡格列酮干預組，每組10只。實驗第1天和第8天，哮喘組及吡格列酮干預組小鼠腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液0.2 mL[含OVA 50 μg和Al(OH)35 mg]致敏,從實驗第15天開始以20 g/L OVA霧化吸入30 min/d激發，連續7 d；吡格列酮干預組于OVA霧化吸入前30 min霧化吸入吡格列酮(5×10-5mol/L)；對照組以生理鹽水代替OVA致敏、激發。末次激發后24 h，體積分數5%的水合氯醛400 mg/kg麻醉小鼠，打開胸腔，結扎右肺門根部，生理鹽水0.3 mL行左肺支氣管肺泡灌洗，共3次，合并得支氣管肺泡灌洗液(BALF)。取右肺組織浸入體積分數10%中性甲醛中固定，經脫水、包埋制成蠟塊，切片后部分行HE染色，部分用于免疫組化檢測。切取左肺葉迅速放入液氮中，速凍后轉移至-80 ℃冰箱中用于RT-PCR檢測。

1.3BALF細胞計數取150 μL BALF 細胞懸液與細胞計數液按11稀釋混勻，顯微鏡下計數細胞總數，其余BALF 4 ℃、2 000 r/min離心10 min，沉淀物涂片，行瑞氏染色，每個標本計數200個細胞。

1.4肺組織病理學觀察取肺組織切片，常規HE染色，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察組織形態、氣道上皮損傷、氣管及血管周圍炎性細胞浸潤情況。

1.5肺組織GABAARα和MUC5AC蛋白的檢測采用免疫組化SP法。切片經常規脫蠟水洗后，檸檬酸修復抗原，用體積分數3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，小鼠抗MUC5AC單克隆抗體、小鼠抗GABAARα單克隆抗體按150稀釋。實驗按試劑盒說明步驟操作。陽性部位呈棕褐色。采用圖像積分光密度分析軟件進行圖像分析，取平均積分光密度值表示目的蛋白的表達水平。

1.6肺組織GABAARα和MUC5ACmRNA的檢測采用RT-PCR法。GABAARα上游引物5’-CAAAGCTCGGATAGGAGAC-3’，下游引物5’-CACT GGTGGGTGGAATGAC-3’，擴增片段大小為167 bp。MUC5AC上游引物5’-TGATGGCCTAGTTGTTGAGC-3’，下游引物5’-ATCTGGCGGAGCAGTTCTT-3’，擴增片段大小為368 bp。GAPDH上游引物5’-ACG GCAAATTCAACGGCACA-3’，下游引物5’-AGGCG GCACGTCAGATCCAC-3’ ，擴增片段大小為589 bp。取約100 mg肺組織，研磨后加入Trizol 1 mL，參照說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以2 μL cDNA為模板行PCR。擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(GABAARα及MUC5AC為56 ℃，GAPDH為58 ℃)，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃總延伸6 min。取5 μL擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統進行分析，以目的基因與內參條帶灰度值之比作為目的基因的相對表達量。

1.7統計學處理采用SPSS 20.0處理數據。3組間BALF細胞總數、嗜酸粒細胞計數和肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白及mRNA表達的比較采用單因素方差分析，多組樣本均數兩兩比較，方差齊者用LSD-t檢驗，方差不齊者用Dunnett’s T3 法檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組小鼠BALF細胞總數和嗜酸粒細胞計數比較見表1。

表1 3組BALF細胞總數和嗜酸粒細胞計數×109 L-1

*:與對照組比較，P<0.05；#:與吡格列酮干預組比較，P<0.05。

2.2 3組小鼠肺組織病理學表現HE染色見：對照組小鼠氣道黏膜上皮正常，氣道周圍無明顯炎性細胞浸潤，肺泡壁結構完整；哮喘組小鼠氣道黏膜上皮局部脫落，黏膜下充血水腫，黏膜層增厚，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎性細胞浸潤；吡格列酮干預組黏膜上皮相對完整，黏膜下充血水腫、氣道壁增厚及炎性細胞浸潤較哮喘組減輕。見圖1。

2.3 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白的表達GABAARα蛋白主要表達于氣道上皮，在基底部無表達，陽性表達產物定位于細胞膜；MUC5AC陽性染色僅見于支氣管上皮細胞，表現為胞漿內可見棕褐色顆粒。哮喘組肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白表達強于吡格列酮干預組，且二者均高于對照組。見圖1和表2。

圖1 3組小鼠肺組織病理學表現及GABAARα和MUC5AC蛋白的表達

A：對照組；B：哮喘組；C：吡格列酮干預組；1：肺組織病理學表現(HE，×400)；2：肺組織中GABAARα蛋白的表達(SP，×400)；3：肺組織中MUC5AC蛋白的表達(SP，×400)。

表2 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白的表達

*:與對照組比較，P<0.05；#:與吡格列酮干預組比較，P<0.05。

2.4 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5ACmRNA的表達哮喘組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA的相對表達量均高于吡格列酮干預組，且二者都高于對照組。見圖2和表3。

圖2 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA的表達

表3 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5ACmRNA的表達

組別nGABAARαmRNAMUC5ACmRNA對照組100．33±0．080．50±0．52哮喘組100．88±0．14?#0．93±0．17?#吡格列酮干預組100．70±0．11?0．71±0．57?F49．92933．937P<0．001<0．001

*:與對照組比較，P<0.05；#:與吡格列酮干預組比較，P<0.05。

3 討論

吡格列酮作為胰島素增敏劑，廣泛應用于糖尿病的治療。其作用機制是高選擇性地激動PPARγ，PPARγ的活化可調節許多控制葡萄糖及脂類代謝的胰島素相關基因的轉錄。近來研究[1-2，4]顯示，PPARγ作為調節糖代謝及脂類的轉錄因子，與2型糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化及腫瘤等慢性疾病的發生密切相關，其還具有顯著的免疫調節和廣泛的抗炎作用。有研究[5]證實PPARγ激動劑能抑制A549細胞釋放趨化因子和細胞因子，降低IgE水平，減少黏液產生、膠質沉積，減輕哮喘患者氣道炎癥反應和氣道高反應性。

氣道黏液高分泌在哮喘的進展中發揮重要作用。MUC5AC起調控氣道黏蛋白合成的作用，反映了氣道黏液分泌的情況。GABA 是重要的抑制性神經遞質。研究[6-7]表明GABA受體和GABA合成酶谷氨酸脫羧酶在氣道上皮細胞中有表達，且組成了一個完善的GABA 系統；此系統參與了杯狀細胞的增生和黏液的過度分泌。GABAAR的抑制減少了哮喘發作時氣道上皮細胞黏液的分泌，并且抑制了氣道重塑[8-9]。

氣道炎癥及氣道重構是支氣管哮喘的重要病理表現。該實驗采用吡格列酮對哮喘模型小鼠進行干預，結果顯示OVA激發的哮喘小鼠氣道和肺組織中出現了明顯的炎癥反應和結構改變，如嗜酸粒細胞為主的炎癥反應、黏液分泌增加以及氣道壁增厚為主的氣道重構；而吡格列酮干預組以上表現較哮喘組減輕，提示吡格列酮可能存在抗炎及抑制氣道重構的作用，此種作用可能通過抑制Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和TLR2表達，使TLR誘導的核因子NF-κB活性降低,下調趨化因子表達而實現[10]。作者觀察到哮喘組肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA及蛋白表達水平均較對照組高，吡格列酮干預后以上指標均降低，GABAARα與MUC5AC變化趨勢一致。由此推斷，吡格列酮減輕氣道黏液過度分泌的過程可能涉及GABAARα, 這對于解釋哮喘的發病機制具有重要意義。吡格列酮可能通過下調GABAARα的表達在哮喘氣道黏液過度分泌中起治療作用，但是GABAARα的表達變化是吡格列酮直接調控的效果，還是由于吡格列酮抑制TLR-NF-κB信號通路激活、下調趨化因子表達進而產生的間接調控作用，仍需要進一步的研究。

[1]Jiang C, Ting AT, Seed B. PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines[J]. Nature，1998, 391(6662):82

[2]Patel HJ, Belvisi MG, Bishop-Bailey D, et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptors in human airway smooth muscle cells has a superior anti-inflammatory profile to corticosteroids: relevance for chronic obstructive pulmonary disease therapy[J]. J Immunol，2003,170(5):2663

[3]朱亞蕊，劉劍波.哮喘小鼠肺和下丘腦組織中γ-氨基丁酸受體ARα的表達[J].鄭州大學學報:醫學版，2012，47(2)：218

[4]Rosen ED,Spiegelman BM.PPARgamma:a nuclear regulator of metabolism,differentiation,and cell growth[J]. J Biol Chem, 2001, 276(41):37731

[5]Oh SH,Park SM,Lee YH,et al.Association of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma gene polymorphisms with the development of asthma[J].Respir Med,2009,103(7):1020

[6]Curran DR, Cohn L. Advances in mucous cell metaplasia: a plug for mucus as a therapeutic focus in chronic airway disease[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2010, 42(3): 268

[7]Xiang YY,Wang SH,Liu MY,et al. A GABAergic system in airway epithelium is essential for mucus overproduction in asthma[J]. Nat Med, 2007, 13(7):862

[8]任旭斌, 劉春濤, 朱濤. 荷包牡丹堿對哮喘小鼠肺組織α-SMA及氣道重構的影響[J]. 四川大學學報：醫學版,2010, 41(4): 626

[9]徐傳芹, 鄭玉龍, 程偉. GABA和一葉秋堿對哮喘小鼠肺功能和黏液的影響[J]. 中國現代醫學雜志,2009, 19(23): 3541

[10]Dasu MR,Park S,Devaraj S,et al.Pioglitazone inhibits Toll-like receptor expression and activity in human monocytes and bd/db mice[J].Endocrinology，2009,150(8):3457

(2013-06-25 收稿 責任編輯 徐春燕)

Influence of pioglitazone on expressions of GABAARα and MUC5AC in lung tissue of asthmatic mice

DUFangyu,LIUJianbo

DepartmentofRespiratoryDisease,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

GABAARα; MUC5AC;pioglitazone; asthma；mouse

Aim: To observe the effects of pioglitazone on the expressions of GABAARα and MUC5AC in lung tissue of asthmatic mice, and to explore new ideas for prevention and treatment of asthma. Methods: Thirty BALB/C mice were randomly allocated into 3 groups(n=10):normal control group,the asthma group,and the pioglitazone intervention group. The latter 2 groups were established asthma model by sensitized and challenged with ovalbumin.The pioglitazone intervention group was given aerosol inhalation of pioglitazone 30 min before each allergen challenge. The pathological changes of the lung tissue were observed by HE staining. The expressions of GABAARα, MUC5AC mRNA and protein in lung tissue were analyzed by RT-RCR and immunohistochemistry. Results: The mice in the asthma group showed mucosal hyperemia and edema, mucosa thickening and severe airway inflammation. These changes alleviated in the pioglitazone intervention group．The expressions of GABAARα,MUC5AC protein and mRNA in the asthma group were higher than those of normal control group(P<0.05),and compared with those of the asthma group, the above indexes in the pioglitazone intervention group decreased but still higher than those in normal control group(P<0.05).Conclusion: Pioglitazone may play a role in the treatment of excessive mucus production through down-regulating the expression of GABAARα.

*河南省科技廳重點科技攻關項目 122102310236

R562.2+5

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.010