褪黑素對大鼠脊髓損傷后腫瘤壞死因子-α表達的影響*

徐玉生，張 松，金偉林，李星晨，崔 浩,王培松，文建國

1)鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

褪黑素對大鼠脊髓損傷后腫瘤壞死因子-α表達的影響*

徐玉生1)△，張 松1)，金偉林1)，李星晨1)，崔 浩1),王培松1)，文建國2)

1)鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

△男，1969年3月生，博士，副教授，副主任醫師，研究方向：骨科疾病的基礎與臨床， E-mail: ysxu@zzu.edu.cn

脊髓損傷；褪黑素；腫瘤壞死因子-α；大鼠

目的：探討褪黑素(MT)對脊髓損傷(SCI)大鼠體內腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達的影響及可能機制。方法108只SD大鼠隨機分為3組。假手術(Sham)組僅行椎板切除不損傷脊髓，SCI組與SCI+MT組采用改良的Allen’s法建立SCI模型；SCI+MT組術后10 min腹腔注射MT(100 mg/kg)，SCI組注射等量體積分數5%乙醇。術后12 h各組選6只取脊髓，采用HE染色法和免疫組化法分別觀察脊髓組織的病理變化和TNF-α蛋白的表達情況。術后1、12、24、48、72 h，各組分別取6只大鼠，用ELISA法檢測血清TNF-α水平，RT-PCR法測定脊髓組織 TNF-α mRNA的表達。結果SCI+MT組病理改變較SCI組明顯減輕。脊髓組織中TNF-α蛋白主要分布在神經元和膠質細胞的胞漿和胞核；3組TNF-α陽性細胞數差異有統計學意義(F=504.239，P<0.001)，其中SCI組最高，SCI+MT組次之，Sham組最低。各時間點3組血清TNF-α水平和脊髓組織中TNF-α mRNA的表達水平差異有統計學意義(P均<0.05)，其中SCI+MT組上述2指標低于SCI組，但仍高于Sham組(P<0.05)。結論MT可能通過抑制TNF-α的表達水平減輕損傷脊髓的繼發性炎癥損傷。

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI) 包括原發性損傷及由原發性因素導致的繼發性損傷。SCI后大量的炎性細胞浸潤及大量炎癥因子的產生是導致脊髓繼發性損傷的主要因素。控制繼發性損傷是SCI早期治療的重要目標之一[1]。近年來, 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在脊髓繼發性損傷中的作用逐漸受到重視,被認為是眾多炎癥因子的始動因子，能上調其他炎癥因子的產生, 在局部炎癥級聯反應中具有重要意義[2]。目前治療SCI最常用的藥物是甲基強的松龍，但大劑量的甲基強的松龍可引起一系列并發癥，如感染、高血壓、急性胃潰瘍等。褪黑素(melatonin,MT)是一種由松果體分泌的神經內分泌激素，具有調節免疫、抗氧化、抗炎等多種生物學功能[3-4]。作者觀察了MT對SCI后不同時期炎癥因子TNF-α表達的影響，進一步明確MT對SCI后炎癥反應影響的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物來源及分組SPF級健康成年雌性SD大鼠108只，體重(300±20) g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。 按隨機數字表分為假手術(Sham)組、SCI+MT組、SCI組，每組36只。術前適應性喂養1周。

1.2主要試劑與儀器Trizol試劑、RT試劑盒、PCR試劑盒和Marker均購自北京全式金生物技術有限公司，引物購自北京博大泰克公司。大鼠TNF-α酶聯免疫(ELISA)分析試劑盒購自美國RD公司。兔抗鼠TNF-α抗體、免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。MT、焦碳酸二乙酯(DEPC)和溴化乙錠(EB)購自美國Sigma公司。PCR 擴增儀(美國Applied Biosystems公司，型號：2700)，低溫離心機(美國Sigma公司，型號：3K30)，D-140圖像記錄分析系統(大連Jim-X Scientific，型號：D140)。

1.3動物模型的建立體積分數10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg), 必要時追加。麻醉生效后，俯臥固定于手術臺上，術區備皮，以T12為中心，常規消毒、鋪巾，背部正中切口，顯露T11至T13，咬除該節段棘突及椎板，暴露相應脊髓段作為損傷區，于硬膜上方放置一長方形塑料墊片(0.4 mm×0.3 mm×0.1 mm)，再采用改良的Allen′s法[5]，將5 g砝碼從高度10 cm處通過導管自由落下，對大鼠脊髓進行定量打擊，建立大鼠急性SCI模型。局部見：打擊處脊髓組織出現水腫、淤血但硬脊膜完整；整體見：大鼠出現擺尾反射，雙下肢及軀體回縮撲動后，雙后肢呈遲緩性癱瘓，表明撞擊成功。隨后用生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉、皮膚。MT按說明書要求，用無水乙醇進行稀釋。術后10 min，SCI+MT組腹腔注射MT 100 mg/kg，SCI組給予等量含體積分數5%乙醇的生理鹽水。Sham組僅咬除棘突及椎板，并未損傷脊髓。術后人工手法壓迫幫助大鼠排尿(白天每4 h 1次)，直至相應時間點取材。

1.4 3組大鼠脊髓組織病理表現及TNF-α蛋白表達的檢測術后12 h每組選取6只大鼠，腹腔注射麻醉后分別用生理鹽水和40 g/L的多聚甲醛行升主動脈灌流固定，以損傷段為中心取約1.5 cm的脊髓組織，40 g/L多聚甲醛固定24 h后石蠟包埋、切片。HE染色觀察脊髓的病理表現。每個標本取同序列切片5張，按照免疫組化試劑盒說明書要求進行TNF-α檢測，以兔抗鼠TNF-α抗體(按200倍稀釋)為一抗，以PBS代替一抗作陰性對照。細胞質及胞核染成黃褐色或黑色為陽性細胞，每張切片計數4個高倍鏡視野中的陽性細胞數，取均值代表該張切片TNF-α蛋白的表達水平。

1.5 3組大鼠血清TNF-α水平及脊髓組織TNF-αmRNA表達的檢測術后1、12、24、48及72 h，每組選取6只大鼠處死。每例樣本取10 μL血清，采用ELISA法檢測TNF-α，按試劑盒說明進行操作，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值，根據標準曲線計算樣品中TNF-α的含量。取損傷段脊髓組織于液氮中保存。每例樣本稱取100 mg凍存的脊髓組織，研碎后加入1 mL Trizol試劑，提取總RNA，逆轉錄得cDNA。取2 mL cDNA按試劑盒說明進行目的基因擴增，以GAPDH為內參。TNF-α上游引物為5’-GAGTGACAAGCCTGTAGCC-3’，下游引物為5’-TTCCCTTCACAGAGCAAT-3’, 擴增產物大小為451 bp。GAPDH上游引物為5’-CGTATCGGACGCCTG GTT-3’，下游引物為5’-CGGAGATGATGACCCTTTT-3’，擴增產物大小為331 bp。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃總延伸6 min。取5 μL擴增產物與緩沖液混合后電泳，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統進行分析，以目的基因和內參條帶灰度值的比值表示目的基因的表達水平。

1.6統計學處理采用 SPSS 17.0處理數據。采用單因素方差分析比較3組大鼠脊髓組織TNF-α陽性細胞數、血清TNF-α水平和脊髓組織中TNF-α mRNA表達水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1術后一般情況Sham組較術前無明顯變化，無神經系統損傷表現。術后早期，SCI組及SCI+MT組大鼠進食及活動明顯減少，均出現不同程度的尿潴留情況，行走時后肢處于拖動狀態；隨著觀察時間的延長，SCI+MT組大鼠活動及進食較SCI組有改善，但后肢運動功能未見明顯改變。

2.2 3組大鼠脊髓組織病理表現和TNF-α蛋白的表達Sham組脊髓組織無充血水腫等變化。SCI組脊髓組織血管充血，細胞水腫，脊髓灰質中部分細胞核濃縮，染色增強，白質中炎性細胞浸潤及少量紅細胞滲出；TNF-α蛋白表達明顯增加，主要存在于神經元和膠質細胞，散在分布在損傷區周圍。SCI+MT組各個時間點病理改變均較SCI組輕，TNF-α蛋白的表達亦減少。見圖1。TNF-α陽性細胞數由高到低依次為SCI組(13.8±0.5)、SCI+MT組(10.3±0.6)和Sham組(3.9±0.2)，3組間相比差異有統計學意義(F=504.239,P<0.001)，且組間兩兩比較差異亦有統計學意義(P<0.05)。

圖1 3組大鼠術后12 h時病理表現和TNF-α蛋白的表達

2.3 3組大鼠血清TNF-α水平的比較SCI組和SCI+MT組血清TNF-α水平在術后12 h達高峰。術后各時間點，SCI+MT組血清TNF-α水平低于SCI組，但仍高于Sham組。見表1。

表1 3組大鼠不同時間點血清TNF-α水平(n=6)

*:與Sham組比較,P<0.001;#:與SCI組比較,P<0.001。

2.4 3組大鼠脊髓組織中TNF-αmRNA表達水平的比較SCI組和SCI+MT組脊髓組織中TNF-α mRNA的表達水平在術后12 h達高峰。術后各時間點，SCI+MT組脊髓組織中TNF-α mRNA的表達水平低于SCI組，但仍高于Sham組。見圖2、3，表2。

圖2 SCI+MT組脊髓組織TNF-α mRNA的表達

圖3 3組大鼠術后12 h脊髓組織TNF-α mRNA的表達

表2 3組大鼠不同時間點脊髓組織TNF-αmRNA檢測結果(n=6)

組別1h12h24h48h72hSham組0．102±0．0050．110±0．0070．104±0．0060．102±0．0100．101±0．006SCI組0．407±0．011?0．841±0．035?0．688±0．028?0．329±0．009?0．190±0．007?SCI+MT組0．269±0．007?#0．518±0．013?#0．414±0．019?#0．201±0．012?#0．123±0．008?#F1944．0001639．0001244．000615．938224．640P<0．001<0．001<0．001<0．001<0．001

*:與Sham組比較，P<0.001;#:與SCI組比較，P<0.001。

3 討論

急性SCI后可引發一系列的炎癥反應等病理生理過程, 導致繼發性損傷。阻斷繼發性損傷是SCI早期治療最重要的目標之一。

TNF-α是具有多種生物活性的炎性細胞因子, 在炎癥反應及免疫調節等方面起重要作用。有研究[6-8]表明SCI后血中TNF-α持續高表達且是最早升高的細胞因子，可上調其他細胞因子的產生，參與了脊髓繼發性損傷的過程。TNF-α能誘導花生四烯酸、脂質過氧化物及氧自由基的產生，上述物質能損傷細胞膜并能增加血管的通透性，這些特性可能與SCI后水腫形成的機制有關[9]。該實驗結果顯示，SCI后12 h，損傷脊髓組織血管充血，細胞水腫，組織內TNF-α表達明顯增加，且主要表達于神經元和膠質細胞，彌散分布在損傷區周圍；血清TNF-α水平和脊髓組織TNF-α mRNA表達水平達高峰；說明TNF-α可能參與了脊髓繼發性損傷過程。因此控制TNF-α的高表達對減輕脊髓繼發性損傷有重要意義。

MT具有高度的脂溶性和水溶性，能透過核膜進入核內發揮作用，因此不僅能保護膜脂質，還能保護蛋白質、核酸及細胞其他成分[10]。作者的前期實驗[11]結果顯示MT能夠提高損傷脊髓抗炎因子IL-10的表達水平，達到保護損傷脊髓的作用。也有文獻[12-13]證實MT有鎮痛作用，并能直接清除自由基，抑制髓過氧化物酶，減輕中性粒細胞介導的毒性損害，具有一定的抗炎作用。相關研究[14]證實MT在肺的煙霧吸入性損傷模型中能夠抑制TNF-α的表達。該研究結果顯示SCI組術后血清TNF-α表達水平較Sham組明顯升高，說明由于術后血脊髓屏障的破壞，來源于血液中高濃度的TNF-α可能參與了脊髓的繼發性損傷。SCI+MT組各時間點血清TNF-α含量及脊髓組織TNF-α mRNA的表達均低于SCI組，脊髓組織TNF-α蛋白的表達明顯減少，局部組織炎癥反應減輕。以上結果證明MT能降低SCI后TNF-α的表達水平，從而減輕SCI后的炎癥反應，對損傷脊髓有保護作用。

MT對SCI保護性治療作用的研究還處于初級階段。作者在前期實驗[11]探討了MT對抗炎因子的促進作用，而該實驗結果顯示MT能抑制促炎因子TNF-α的表達，進一步證明了MT對SCI大鼠有保護作用,對SCI的科研及臨床治療有重要的參考意義。該實驗僅初步探討了MT對SCI后TNF-α表達的影響，仍有不足之處，如只觀察了MT對單一炎癥因子表達的影響，其中的具體機制尚需要進一步實驗研究。

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(2013-08-22 收稿 責任編輯 徐春燕)

Effects of melatonin on expression of TNF-α in rats with acute spinal cord injury

XUYusheng1),ZHANGSong1),JINWeilin1),LIXingchen1),CUIHao1),WANGPeisong1),WENJianguo2)

1)DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

2)InstituteofClinicalMedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

spinal cord injury; melatonin; tumor necrosis factor-α;rat

Aim: To investigate the effects of melatonin(MT) on the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α) in acute spinal cord injury(SCI) rats. Methods:A total of 108 SD rats were randomly allocated into three groups:Sham group only accepted laminectomy without SCI， and SCI group and SCI+MT group used the modified Allen's method to establish SCI model. 100 mg/kg MT was given to the rats in SCI+MT group, and 5% ethanol, to SCI group at 10 min after the model establishment．At 12 h, spinal cord samples of 6 rats from each group were prepared for histological examination using HE and immunohistochemical SP staining to detect the expression of TNF-α. At 1,12,24,48 and 72 h, 6 rats in each group were executed,the serum level of TNF-α was determined by ELISA, and the expression of TNF-α mRNA was detected by RT-PCR.Results: Compared with SCI group,the pathological changes in SCI+MT group were significantly alleviated.Immunohistochemical staining showed that TNF-α protein in spinal cord tissue mainly located in the cytoplasm and nucleus of neurons and glial cells;SCI group was the highest，SCI+MT group followed, and Sham group was the lowest(F=504.239，P<0.001). At different time points, the serum level of TNF-α and the expression of TNF-α in spinal cord tissue in SCI+MT group were significantly lower than those in SCI group, but still higher than those in Sham group(P<0.05). Conclusion: MT may reduce secondary injury of SCI by inhibiting the expression of TNF-α.

*鄭州市科技攻關計劃項目 2010S0828

R681.5+4

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.012