CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶快速檢測方法的建立*

郭小兵，代志峰，宋海容，張傅山，葉亞菲，明 亮

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶快速檢測方法的建立*

郭小兵△，代志峰，宋海容，張傅山，葉亞菲，明 亮

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

△男，1971年8月生，博士，副教授，研究方向：細(xì)菌耐藥機(jī)制，E-mail：gxbing928@126.com

CTX-M-38；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

目的：建立一種CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的快速檢測方法。方法采用梅花形雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測酶蛋白與抗體反應(yīng)最適比；根據(jù)雙抗體夾心法原理設(shè)計(jì)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒；平行測定30次BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物，檢測批內(nèi)變異；分別采用所建立的ELISA法與PCR技術(shù)對146株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行檢測，評價(jià)方法特異性；對27株非產(chǎn)CTX-M-38型產(chǎn)酶大腸埃希菌進(jìn)行檢測，計(jì)算假陽性率；對產(chǎn)CTX-M-38型ESBLs菌株不同時(shí)間段培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，明確最適檢測時(shí)間。結(jié)果抗體與4 h培養(yǎng)物反應(yīng)最適比為164；批內(nèi)檢測結(jié)果變異系數(shù)為1.525%；PCR及所建立的ELISA法檢測產(chǎn)CTX-M-38型ESBLs菌株的檢出率分別為4.11%和7.53%(χ2=2.286,P=0.131)；交叉反應(yīng)中存在假陽性現(xiàn)象(1/27)；產(chǎn)酶菌株培養(yǎng)4 h后進(jìn)行ESBLs檢測較為合適。結(jié)論所建立的方法適用于臨床產(chǎn)CTX-M-38型ESBLs菌株的檢測。

目前，產(chǎn)CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs)菌株在臨床上已有報(bào)道。基于其廣泛耐藥性，建立一種快速檢測方法對于有效控制該類產(chǎn)酶菌株感染以及遏制耐藥性擴(kuò)散非常重要。產(chǎn)酶菌株的常用檢測方法主要有表型及基因型檢測兩種，前者檢測周期長且特異性不佳，后者往往需要特殊儀器設(shè)備，且檢測成本高。免疫學(xué)技術(shù)在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用為產(chǎn)ESBLs菌株的檢測提供了新的思路。酶蛋白合成以后并非存在于菌體包涵體內(nèi)，而是由細(xì)菌分泌至菌體外；其次，酶蛋白相對分子質(zhì)量大，具有多種獨(dú)特性空間構(gòu)象，因此其免疫原性與免疫反應(yīng)性較好；這些特點(diǎn)均利于免疫學(xué)檢測，即采用ELISA法進(jìn)行產(chǎn)酶菌株的檢測。產(chǎn)ESBLs菌株主要為腸桿菌科細(xì)菌[1-2]。作者在前期研究[3]中已制備CTX-M-38型ESBLs的抗體，為該研究中建立酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測產(chǎn)酶菌株提供了實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1菌株來源所有菌株均來源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)菌室。BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子由作者所在研究室自行構(gòu)建，用于明確酶蛋白與抗體反應(yīng)最適比；產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌146株，用于評價(jià)方法的特異性；產(chǎn)單一型別ESBLs大腸埃希菌27株(產(chǎn)TEM-1菌株12株、SHV-12菌株8株、CTX-M-14菌株5株、CTX-M-1 菌株2株)，用于明確檢測方法交叉反應(yīng)狀況；產(chǎn)CTX-M-38型ESBLs大腸埃希菌1株，用于明確ESBLs最適檢測時(shí)間；ATCC25922大腸埃希菌購于溫州康泰生物科技有限公司。所有菌株經(jīng)Vitek 2鑒定到種；酶型及菌株分布經(jīng)PCR檢測鑒定。

1.2主要試劑LB培養(yǎng)基、藥敏紙片購于英國Oxoid公司，M-H瓊脂購于鄭州貝瑞特生物技術(shù)有限公司，溴化乙錠、瓊脂糖、DNA Marker DL2000購于鄭州寶信生物工程科技有限公司，氨芐青霉素購于上海第四制藥廠，硫酸卡那霉素購于石家莊制藥廠，PCR試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.3酶蛋白與抗體反應(yīng)最適比測定收集BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子4 h培養(yǎng)物，提取酶蛋白并調(diào)整質(zhì)量濃度至5 mg/L備用。制備15 g/L瓊脂糖平板，按照圖1打孔。用PBS按照116、132、164、1128、1256及1512對抗體進(jìn)行稀釋。在瓊脂板中央實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)滴加15 μL酶蛋白溶液，周邊實(shí)驗(yàn)孔從1號加樣孔開始，按照逆時(shí)針方向滴加相應(yīng)滴度抗體，將培養(yǎng)皿放置于濕盒內(nèi)，37 ℃孵育24～48 h，觀察結(jié)果。以抗原抗體復(fù)合物沉淀線居反應(yīng)孔中間時(shí)的稀釋度為反應(yīng)最適比[4]。

圖1 雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

1.4抗體的標(biāo)記與ELISA反應(yīng)板的制備采用改良過碘酸鈉法及50%飽和硫酸銨沉淀法完成抗體的標(biāo)記與純化，采用常用酶標(biāo)技術(shù)制備ELISA反應(yīng)板。結(jié)果判斷參照全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程規(guī)定，以P/N比值判斷，P/N≥2.1為陽性[5]。

1.5批內(nèi)變異檢測將BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)種于含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)2 h后，加入IPTG培養(yǎng)過夜。提取表達(dá)產(chǎn)物，按照雙抗體夾心ELISA法操作流程，將其分別加入ELISA反應(yīng)板中，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)(30孔)。測定各孔吸光度值，并計(jì)算變異系數(shù)(CV)，明確批內(nèi)變異。分別設(shè)ATCC25922大腸埃希菌及LB培養(yǎng)液為陰性對照及空白對照。

1.6特異性檢測選取臨床分離產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌146株，每株平行接種于2管液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜后，一管提取菌株所攜帶質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測(上游引物5’-ATGATGACTCAGAGCA-3’，下游引物5’-AGTCAGAAACCGTGGG-3’，擴(kuò)增片段大小為896 bp，采用100 μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系)；另一管提取表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行雙抗體夾心ELISA檢測。2組均以ATCC25922大腸埃希菌及BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子為陰性、陽性對照。

1.7交叉反應(yīng)檢測收集27株臨床分離產(chǎn)單一型別ESBLs大腸埃希菌(不攜帶CTX-M-38型ESBLs)，分別接種于液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜后，提取表達(dá)產(chǎn)物，按照雙抗體夾心ELISA法操作流程對各個菌株產(chǎn)物進(jìn)行檢測，觀察分析檢測結(jié)果。同時(shí)以ATCC25922大腸埃希菌、BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子及LB培養(yǎng)液為陰性、陽性及空白對照。若檢測結(jié)果出現(xiàn)陽性，則表明該法存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象。

1.8ESBLs最適檢測時(shí)間挑取已確證產(chǎn)CTX-M-38型ESBLs大腸埃希菌菌株，接種于5管液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)2、4、8、18及24 h取出1管培養(yǎng)液，提取酶表達(dá)產(chǎn)物，采用雙抗體夾心ELISA法進(jìn)行3孔平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)檢測結(jié)果，確定臨床分離大腸埃希菌中ESBLs的最適檢測時(shí)間。以ATCC25922大腸埃希菌為陰性對照。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0處理數(shù)據(jù)。采用配對χ2檢驗(yàn)比較應(yīng)用PCR和雙抗體夾心ELISA法檢測產(chǎn)CTX-M-38型ESBLs菌株的檢出率，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1酶蛋白與抗體反應(yīng)最適比由梅花形雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)可知，當(dāng)抗體滴度為164時(shí)，抗原抗體比例較為合適。

圖2 抗原抗體最適比檢測

2.2批內(nèi)變異陰性對照與空白對照吸光度分別為0.05及0.01，30個實(shí)驗(yàn)孔吸光度為(1.51±0.02)，表明實(shí)驗(yàn)孔均為陽性結(jié)果。CV為1.525%，表明所建立的方法批內(nèi)誤差不大，可滿足臨床檢測要求。

2.3特異性146株臨床分離產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中，PCR檢測產(chǎn)CTX-M-38型ESBLs者有6株，占4.11%；雙抗體夾心ELISA法檢測出11株，占7.53%，2方法相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.286，P=0.131)。見表1。

表1 PCR與雙抗體夾心 ELISA法檢測產(chǎn)CTX-M-38型ESBLs菌株結(jié)果分析

2.4交叉反應(yīng)27株臨床分離產(chǎn)單一型別ESBLs(非產(chǎn)CTX-M-38型)菌株中，有1株檢測結(jié)果為陽性，表明該法存在假陽性現(xiàn)象。

2.5ESBLs最適檢測時(shí)間陰性對照的吸光度為0.01，2 h管達(dá)到0.46左右，4 h及以后各管吸光度均超過1.00，且改變不大，提示產(chǎn)酶菌株培養(yǎng)2 h即有酶產(chǎn)生，4 h及以后產(chǎn)酶達(dá)到高峰。見表2。

表2 ESBLs檢測不同時(shí)間的吸光度

3 討論

基于產(chǎn)ESBLs菌株的廣譜抗藥性及其廣泛流行趨勢，快速檢測、早期診斷成為遏制其進(jìn)一步擴(kuò)散，提高臨床抗感染治療效果的關(guān)鍵[6]。ESBLs為胞外酶，宿主菌合成后釋放于胞漿間隙，在培養(yǎng)液中可有酶的存在。據(jù)此作者設(shè)計(jì)了雙抗體夾心ELISA法檢測ESBLs。該研究建立的雙抗體夾心ELISA法用于產(chǎn)ESBLs菌株的快速檢測，可為臨床及時(shí)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

3.1抗原抗體最適比抗原抗體只有比例合適時(shí)才會產(chǎn)生最佳反應(yīng)效果，避免形成前帶或后帶現(xiàn)象[7]。作者采用梅花形雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)判斷CTX-M-38型ESBLs酶蛋白與抗體反應(yīng)最適比。考慮全自動微生物快速鑒定時(shí)間為4 h，故實(shí)驗(yàn)中抗原濃度選擇4 h培養(yǎng)物，抗體進(jìn)行倍比稀釋。結(jié)果顯示，抗體效價(jià)為164時(shí)，沉淀線出現(xiàn)在兩反應(yīng)孔中間位置，表明抗體與4 h培養(yǎng)物反應(yīng)的最適效價(jià)為164。

3.2批內(nèi)變異與特異性由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，該法CV值為1.525%，提示批內(nèi)變異較小。目前，對于ESBLs的檢測，PCR檢測技術(shù)除準(zhǔn)確度與特異性較高外，尚可進(jìn)一步分析型間差異，故多作為其他檢測方法的對照[8]。在對146株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的檢測中，PCR技術(shù)的檢出率為4.11%，該法為7.53%，2種檢測方法檢測結(jié)果無差異，提示該法具有一定的特異性，可滿足臨床檢測需要。

3.3交叉反應(yīng)27株已確證為非產(chǎn)CTX-M-38型ESBLs菌株中，有1株檢測結(jié)果為假陽性。CTX-M型ESBLs存在著多種亞型，根據(jù)核苷酸序列同源性可將該型ESBLs細(xì)分為5組，各亞型組間同源性仍在80%以上，組內(nèi)可達(dá)90%以上；其中CTX-M-14型ESBLs流行性最廣，是我國主要流行型別之一[9-11]，且與CTX-M-38核苷酸序列高度同源，酶蛋白間有多種共同抗原。該研究中所制備抗體為CTX-M-38型ESBLs多克隆抗體，一旦宿主菌同時(shí)攜帶CTX-M-14型ESBLs，假陽性結(jié)果在所難免。此外，ELISA檢測板制備過程中關(guān)鍵一環(huán)在于封閉。封閉不當(dāng)亦可導(dǎo)致假陽性結(jié)果。操作流程中，最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是洗滌，洗滌效果不佳也會導(dǎo)致結(jié)果假陽性[12-13]。隨著單克隆抗體的成功制備與應(yīng)用，假陽性可避免或顯著減少。

3.4最適檢測時(shí)間ESBLs最適檢測時(shí)間的確定涉及兩個方面。一為宿主菌產(chǎn)酶過程，二要考慮整個微生物鑒定流程。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，宿主菌在培養(yǎng)2 h后即有酶蛋白產(chǎn)生，4 h時(shí)酶量顯著增多，8、18及24 h吸光度改變不大。結(jié)合檢驗(yàn)流程，該研究確定ESBLs最適檢測時(shí)間為菌株培養(yǎng)4 h。

綜上所述，該研究采用雙抗體夾心ELISA法檢測CTX-M-38型ESBLs，操作簡單，特異性高，可較好地滿足臨床檢驗(yàn)要求。

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(2013-04-13 收稿 責(zé)任編輯 徐春燕)

Establishment of a quick detection method of CTX-M-38 type ESBLs

GUOXiaobing，DAIZhifeng，SONGHairong，ZHANGFushan，YEYafei，MINGLiang

ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

CTX-M-38；ESBLs；ELISA

Aim: To establish a quick detection method of CTX-M-38 type ESBLs. Methods: The reaction optimal ratio between CTX-M-38 type ESBLs and polyclonal antibody was confirmed by double agar diffusion test. The ELISA kit was designed according to double-antibody sandwich principle. The products of CTX-M-38 transformant were detected 30 times to obtain the information of experimental repeatability and intraassay variation;146 ESBLs-producingE.colistrains were detected by PCR and the designed method respectively to evaluate the experimental specificity; 27 isolates of ESBLs-producingE.colistrains(not carrying CTX-M-38 type ESBLs) were detected to evaluate the experimental cross-reactivity;the culture medium of CTX-M-38 type ESBLs-producingE.coliwas detected at various time to confirm the optimal detective time of ESBLs. Results: The reaction optimal ratio between CTX-M-38 type ESBLs and polyclonal antibody was 164; the results of the parallel testing indicated that the CV was 1.525%；the detection rate of PCR and ELISA was 4.11% and 7.53%(χ2=2.286,P=0.131); the designed ELISA might have the phenomenon of false-positivity(1/27); the optimal detection time for ESBLs was being cultured for 4 h. Conclusion: The established ELISA can meet the need for detecting CTX-M-38-type ESBLs-producing strains.

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項(xiàng)目 2011020014

R392

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.018