富血小板纖維蛋白對人牙周膜成纖維細胞遷移及成骨分化的影響

李 瑋，李坤陽，范 云，余方方，陳 棟#

1)鄭州人民醫院頤和醫院口腔科 鄭州 450008 2)鄭州市口腔醫院牙周科 鄭州 450000 3)鄭州大學口腔醫學院 鄭州 450052

富血小板纖維蛋白對人牙周膜成纖維細胞遷移及成骨分化的影響

李 瑋1)，李坤陽2)，范 云3)，余方方3)，陳 棟3)#

1)鄭州人民醫院頤和醫院口腔科 鄭州 450008 2)鄭州市口腔醫院牙周科 鄭州 450000 3)鄭州大學口腔醫學院 鄭州 450052

#通訊作者，男，1971年10月生，博士，副主任醫師，研究方向：牙周病病因防治，E-mail：chendongfmmu@163.com

牙周膜成纖維細胞；富血小板纖維蛋白；遷移；成骨分化

目的：觀察Choukroun’s富血小板纖維蛋白(PRF)對自體人牙周膜成纖維細胞(hPDLCs)遷移、成骨分化的影響，探討PRF在牙周組織再生治療中的潛能。方法原代培養hPDLCs；制備PRF，實驗分為P1組(1片PRF浸出液)、P2組(2片PRF浸出液)和對照組，劃痕實驗觀察記錄各組第24、48、72 h細胞遷移的距離；Transwell制備遷移模型，按實驗分組培養24 h后結晶紫染色觀察；成骨礦化誘導液制備不同濃度的PRF浸出液(P1組、P2組)，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒檢測3、5、7 d細胞破碎液中ALP活性；成骨礦化誘導液連續培養21 d，茜素紅染色后測定礦化結節面積。結果劃痕實驗中P1組、P2組細胞遷移距離大于對照組(F=316.248、32.846和1 169.847，P均<0.001)，P1組、P2組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。Transwell 遷移實驗中P1組、P2組與對照組比較，遷移細胞數增加(F=742.729，P<0.001)，P1組、P2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。ALP活性P1組、P2組與對照組比較差異均有統計學意義(F=474.202、1 383.521、2 317.965，P均<0.001)，P1組、P2組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。P1組、P2組與對照組礦化結節面積比較差異有統計學意義(F=332.280，P<0.001)，P1組與P2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論PRF對hPDLCs具有促進其遷移和成骨分化的作用，提示PRF在牙周組織再生工程中具有很大的臨床應用潛能。

Choukroun’s富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)是通過自體外周血一次離心獲取的富含白細胞和血小板的纖維蛋白凝膠。血小板在組織抗感染和愈合過程中起著重要的作用，其釋放的各種生長因子可影響細胞的附著、增殖等一系列生物學行為，被用于各種組織修復的臨床治療[1]。許多研究[2]都是為了尋找更好的促進牙周組織再生的方法，包括生長因子的應用、EMD處理根面等，但這些治療的臨床效果尚不能完全確定，且增加了患者的經濟負擔，因此需要尋找一種經濟有效的生物活性材料用于牙周組織再生治療。目前少有PRF對牙周膜細胞遷移及成骨分化影響的實驗研究，該實驗將PRF浸出液與人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)共培養，體外觀察PRF對hPDLCs生物學行為的作用，為PRF應用于牙周組織再生工程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑胎牛血清(Gibco公司，美國)，RPMI 1640培養基(Solarbio公司，北京)，CCK-8(同仁公司，日本)，Transwell 小室(Corning公司，美國)，堿性磷酸酶檢測試劑盒(建成公司，南京)，成骨誘導分化培養液(賽業公司，廣州)。

1.2hPDLCs原代培養及鑒定經鄭州大學倫理委員會討論批準，向每位被采集牙周膜組織的患者充分說明該實驗的性質、目的、可能的收益和風險以及《赫爾辛基宣言》規定的原則和義務，在沒有強迫、不正當壓力和引誘的情況下，與每位受試患者簽署《富血小板纖維蛋白研究知情同意書》。取材于河南省口腔醫院收治的12～18歲因正畸拔除的牙周健康、無齲壞的新鮮前磨牙。酶消組織塊法原代培養hPDLCs，免疫熒光法DAPI染色鑒定。

1.3PRF及其浸出液的制備采用Choukroun方法制備PRF[1]，無菌采血管采取牙周膜組織來源同一患者肘靜脈血，3 000 r/min離心10 min，靜置10 min，剪去紅細胞層，無菌紗布輕壓10 s制成膜片。

取5 mL血液制備1片PRF膜片，將1片和2片PRF分別放入無菌EP管中，加入5 mL含體積分數2%或不含 FBS的RPMI 1640及成骨分化誘導培養液，CO2恒溫培養箱孵育24 h。吸出浸出液于EP管中，4 ℃保存[3]。

1.4劃痕實驗觀察PRF對hPDLCs遷移的影響6孔板背后劃平均寬度的5條平行橫線，調整細胞濃度為5×105mL-1后接種于6孔板。待細胞長滿后，用10 μL的槍頭劃1條垂直于橫線的劃痕，劃破單層細胞。分別加入1片PRF(P1組)、2片PRF(P2組)的浸出液，對照組加入不含PRF的RPMI 1640培養液。每組設3個復孔，培養24、48、72 h。40倍顯微鏡下拍照記錄遷移距離。

1.5Transwell檢測PRF對hPDLCs遷移的影響

取24孔板，按1.4分組分別加入600 μL培養液。將Transwell小室放入24孔板內，并加入1×105mL-1100 μL的無血清細胞懸液，孵育24 h。固定，結晶紫染色，棉簽擦去小室內面未遷移的細胞。200倍顯微鏡下觀察，每孔選取10個視野拍照，計數，計算平均值。

1.6PRF對hPDLCs堿性磷酸酶活性的影響采用成骨誘導培養液配制PRF浸出液，調整細胞濃度為2×104mL-1后接種于24孔板，按1.4分組加入培養液，收集3、5、7 d的細胞制備細胞破碎液。按照堿性磷酸酶檢測試劑盒說明進行加樣，測定吸光度值，即為堿性磷酸酶活性。實驗重復10次。

1.7PRF誘導hPDLCs成骨分化的觀察調整細胞濃度為2×104mL-1后接種于6孔板，細胞長至60%～70%時，按1.4分組換液，連續培養21 d。固定，茜素紅染色，200倍顯微鏡下觀察、拍照。從各組染色結果選取10個檢測位點，采用Image Pro Plus 6.0對礦化結節面積進行測量，結果取平均值。

1.8統計學處理采用SPSS 17.0對數據進行分析。對照組、P1組和P2組細胞遷移距離、細胞遷移數、堿性磷酸酶活性、礦化結節面積的比較以及不同時間細胞遷移距離、堿性磷酸酶活性的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1hPDLCs的原代培養及鑒定所培養的hPDLCs呈典型的成纖維樣細胞形態，抗波形絲蛋白免疫熒光染色呈陽性，抗角蛋白免疫熒光染色呈陰性，所培養hPDLCs為間充質來源(圖1)。

圖1 hPDLCs免疫熒光鑒定結果(DAPI，×200)

2.2PRF及其浸出液的制備離心后管內容物分為3層：淡黃色上清為貧血小板血漿(platelet-poorplasma，PPP)，紅色液體為紅細胞，中間層淺黃色凝膠為PRF；剪去底部的紅細胞層，無菌紗布壓制形成白色膜片(圖2)。

圖2 PRF制備形成的3層結構

A：離心后的3層結構，即PPP、PRF、紅細胞層；B：PRF凝膠；C：PRF膜片。

2.3劃痕實驗觀察PRF對hPDLCs遷移的影響結果見圖3、表1。P1組和P2組細胞遷移的距離隨時間增加逐漸增加，且P1組和P2組細胞遷移的距離大于對照組，但P1組和P2組比較差異無統計學意義。

圖3 劃痕實驗細胞遷移的情況(×40)

2.4Transwell檢測PRF對hPDLCs遷移的影響

結果見表2和圖4。P1組、P2組細胞遷移數大于對照組，P1組、P2組比較差異無統計學意義。

表1 各組細胞遷移距離比較(n=3) mm

*：與對照組比較，P<0.001; #：與24 h比較，P<0.001。

表2 各組細胞遷移數和礦化結節面積的比較(n=10)

*：與對照組比較，P<0.001。

圖4 各組細胞遷移情況和礦化結節的形成(×200)

2.5PRF對hPDLCs堿性磷酸酶活性的影響結果見表3。各組堿性磷酸酶活性隨時間的增加持續增加，且P1組、P2組活性均高于對照組，但P1組、P2組比較差異無統計學意義。

表3 各組hPDLCs堿性磷酸酶活性比較(n=10)

*：與對照組比較，P<0.001；#：與3 d比較，P<0.001。

2.6PRF誘導hPDLCs成骨分化的觀察結果見圖4、表2。hPDLCs經成骨誘導后表現成骨潛能，茜素紅染色發現P1組、P2組礦化結節面積較對照組增加。

3 討論

牙周基礎治療和非手術治療主要是控制炎癥，治療后往往形成的是長結合上皮性愈合，牙周組織再生治療則是使牙周炎造成的已破壞的牙周組織重建，恢復其結構和功能。其關鍵在于具有多向分化功能的牙周膜細胞在時間和空間上優先占領牙根面，形成新的牙骨質、膠原纖維和牙槽骨，獲得真正的新附著[4]。

Choukroun’s PRF能夠釋放大量生長因子：轉化生長因子-β、血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子、血管內皮生長因子等，這些生長因子在PRF制備完成60 min內逐漸增加，在120～300 min內迅速釋放[5]，能夠促進細胞增殖、分化、遷移，誘導基質礦化和骨基質蛋白的分泌，誘導新生血管的形成，為組織修復提供氧氣及營養物質[1]。Tsai等[6]研究發現PRF可促進hPDLCs及成骨細胞增殖而抑制牙齦上皮細胞增殖，這種細胞選擇性可以避免長結合上皮的形成。該研究結果顯示2種濃度的PRF浸出液對自體hPDLCs的遷移具有明顯的促進作用，2個實驗組hPDLCs遷移的距離和數量均高于對照組，提示PRF能夠促進hPDLCs遷移，有利于hPDLCs在牙周組織愈合過程中優先占領根面，形成新附著。

PDLCs成骨細胞表型可以在牙周組織修復中不斷形成新的牙骨質及牙槽骨，對于牙周組織再生有著重要的作用[1]。堿性磷酸酶是參與骨組織形成、代謝和再生的重要調節物質，可反映細胞向成骨分化的趨勢[7]。該實驗結果表明PRF能夠增加hPDLCs的堿性磷酸酶活性，提示PRF通過促進hPDLCs分泌與成骨相關的堿性磷酸酶、促進礦化結節的形成，來提高hPDLCs成骨分化和骨形成的能力。

hPDLCs優先占領根面、快速增殖、向成骨分化形成牙骨質和牙槽骨是新附著形成的關鍵，該實驗結果提示PRF通過影響這一愈合過程達到促進牙周組織再生的治療目的。PRF取自自體，不添加任何人工制劑，可以避免免疫排斥和交叉感染的發生，使用安全簡便，能夠作為一種天然的、經濟有效的、促進組織修復的自體生物活性材料應用于牙周組織再生。以往研究[8-9]表明PRF對成骨細胞、骨髓間充質干細胞的增殖具有促進作用，并表現有劑量依賴性。該實驗設有2種濃度的PRF浸出液，觀察PRF對hPDLCs作用是否具有劑量依賴性。結果與以往研究結果有所差異，未表現出劑量依賴性，可能是PRF作用方式和PRF浸出液制備方法不同導致，需要進一步的實驗來確定。

[1]Choukroun J, Diss A, Simonpieri A, et al. Platelet-rich fibrin(PRF): a second-generation platelet concentrate. Part Ⅳ: clinical effects on tissue healing[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2006,101(3):e56

[2]Ramseier CA, Rasperini G, Batia S, et al. Advanced reconstructive technologies for periodontal tissue repair[J].Periodontol 2000, 2012,59(1):185

[3]李龍，趙建輝，劉斌，等. 富血小板纖維蛋白體外釋放VEGF影響因素的探討[J].中國美容醫學,2012，21(3):427

[4]曹采方.臨床牙周病學[M].北京: 北京大學醫學出版社，2009.

[5]Su CY, Kuo YP， Tseng YH,et al. In vitro release of growth factors from platelet-rich fibrin (PRF): a proposal to optimize the clinical applications of PRF[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2009,108(1):56

[6]Tsai CH, Shen SY，Zhao JH,et al. Platelet-rich fibrin modulates cell proliferation of human periodontally related cells in vitro[J].J Dent Sci,2009,4(3):130

[7]Pavlin D, Dove SB, Zadro R,et al. Mechanical loading stimulates differentiation of periodontal osteoblasts in a mouse osteoinduction model: effect on type Ⅰ collagen and alkaline phosphatase genes[J].Calcif Tissue Int,2000,67(2):163

[8]Dohan Ehrenfest DM, Doglioli P, de Peppo GM,et al. Choukroun’s platelet-rich fibrin (PRF) stimulates in vitro proliferation and differentiation of human oral bone mesenchymal stem cell in a dose-dependent way[J].Arch Oral Biol, 2010,55(3):185

[9]Dohan Ehrenfest DM, Diss A, Odin G, et al. In vitro effects of Choukroun’s PRF (platelet-rich fibrin) on human gingival fibroblasts, dermal prekeratinocytes, preadipocytes, and maxillofacial osteoblasts in primary cultures[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2009,108(3):341

(2013-04-23 收稿 責任編輯 姜春霞)

Effects of platelet-rich fibrin on human periodontal ligament cells migration and osteogenetic differentiation

LIWei1)，LIKunyang2)，FANYun3)，YUFangfang3)，CHENDong3)

1)DepartmentofStomatology,YiheHospital,ZhengzhouPeople’sHospital,Zhengzhou450008 2)DepartmentofPeriodontology,StomatologicalHospitalofZhengzhouCity，Zhengzhou450000 3)SchoolofStomatology,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

periodontal ligament cell; platelet-rich fibrin; migration; osteogenetic differentiation

Aim: To investigate the effects of platelet-rich fibrin(PRF) on the migration and osteogenetic differentiation of human periodontal ligament cells(hPDLCs), and to evaluate the potential value of PRF used in periodontal tissue regeneration. Methods: The hPDLCs were primarily cultured and the PRF was prepared. There were three groups: 1 piece of PRF group (P1 group), 2 pieces of PRF group (P2 group), and control group. The cell migration distances at the 24th, 48th, 72th h were recorded under microscope in scratches experiment. Transwell was used to prepare migration model, and the results were observed by crystal violet staining after 24 h. Alkaline phosphatase(ALP) activity was detected by the kits of ALP at three time points. hPDLCs were induced differentiation by osteogenesis mineralization fluid and to observe mineralized nodules after being cultured for 21 days. Results: Scratch experimental results showed that the cell migration distances of the experimental groups were significantly greater than that of the control group (F=316.248，32.846, and 1 169.847,P<0.001), but there was no significant difference between two experimental groups (P>0.05). Transwell migrating experiment showed that compared with control group, the cells of the experimental groups migrating to the outside of the Transwell chambers were significantly more than that of control group (F=742.729，P<0.001), but there was no significant difference between the two experimental groups (P>0.05). The ALP activity of P1 group and P2 group were significantly more than that of control group (F=474.202，1 383.521，2 317.965，P<0.001), but there was no significant difference between P1 group and P2 group (P>0.05). There were significant differences in mineralized nodule area between experimental groups and control group (F=332.280，P<0.001), but there was no significant difference between P1 group and P2 group(P>0.05). Conclusion: PRF could promote hPDLCs migration and osteogenetic differentiation, and PRF may have great potential value in clinical application of periodontal tissue engineering.

R781.4

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.031