ADAM9特異性siRNA對腎透明細胞癌786-0細胞ADAM9基因表達及體外侵襲能力的影響

張新恒，馬曜輝，單中杰

1)新鄉醫學院研究生處 新鄉 473003 2)鄭州人民醫院泌尿外科 鄭州 450003

ADAM9特異性siRNA對腎透明細胞癌786-0細胞ADAM9基因表達及體外侵襲能力的影響

張新恒1)，馬曜輝1)，單中杰2)#

1)新鄉醫學院研究生處 新鄉 473003 2)鄭州人民醫院泌尿外科 鄭州 450003

#通訊作者，男，1964年12月生，博士，教授，研究方向：尿路疾病，E-mail：shanzhongjie@vip.sina.com

腎透明細胞癌；去整合素金屬蛋白酶9；侵襲

目的：探討去整合素金屬蛋白酶9(ADAM9)特異性siRNA對人腎透明細胞癌(RCCC)786-0細胞中ADAM9基因表達及體外侵襲能力的影響。方法設計合成ADAM9特異性siRNA。將786-0細胞分4組處理，分別為正常對照組(正常培養786-0細胞)、空脂質體轉染組、陰性轉染組(轉染無義 siRNA)和ADAM9 siRNA轉染組。轉染24、48、72 h后，采用RT-PCR法檢測細胞ADAM9 mRNA的表達；轉染48 h后，采用Western blot法檢測細胞ADAM9蛋白的表達， 并用Transwell法檢測細胞侵襲能力。結果轉染24、48、72 h后，ADAM9 siRNA轉染組786-0細胞ADAM9 mRNA的表達顯著低于其他3組(F=47.945、180.456、60.978，P均<0.001)；轉染48 h后，ADAM9 siRNA轉染組786-0細胞ADAM9蛋白表達顯著降低(F=142.816，P<0.001)，穿膜細胞數顯著減少(F=45.389，P<0.001)。結論ADAM9特異性siRNA能夠有效沉默786-0細胞中ADAM9的表達并降低其體外侵襲能力。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是在mRNA水平上沉默基因表達的過程，目前RNAi已成為研究基因功能的一種重要的實驗方法[1]。腎透明細胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)是最常見的成年人腎臟惡性腫瘤，由于癌細胞可表達多種耐藥蛋白,因此對常規化療不敏感，對放療也不敏感。對于晚期腎癌或轉移癌，近年的分子靶向治療雖取得了一定的成績，但總體上存在著完全緩解率低、有一定副作用、個體差異顯著等問題[2]。去整合素金屬蛋白酶9(a disintegrin and metalloprotease 9，ADAM9)是去整合素金屬蛋白酶家族成員之一，在RCCC組織中高表達并與患者的腫瘤進展及不良預后相關[3]，但其促進腫瘤進展的具體機制尚不明確。作者采用RNAi、RT-PCR、Western blot、Transwell等方法探討了ADAM9特異性siRNA對人RCCC 786-0細胞中ADAM9基因的表達及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料786-0細胞及專用培養基購自武漢博士德生物工程有限公司。ADAM9特異性siRNA ADAM9-siRNA-2366：正義鏈5’-CCAGAGA AGUUCCUAUAUA-3’，反義鏈5’-UAUAUAGGAAC UUCUCUGG-3’； 無義siRNA(NC siRNA)：正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ ，反義鏈5’-AAA CGUGACACACGUUCGGAGAA-3’。上述siRNA均由美國百奇公司設計合成。轉染試劑LipofectamineTM2000及低血清培養基購自美國Invitrogen公司。ADAM9引物(上游 5’-CATTGAGGGAGGGACTTCT GGT-3’，下游5’-ATGGGAACTGCTGAGGTTGCTT-3’，產物大小282 bp)由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。β-actin引物(上游5’-TGACGTGGACATC CGCAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAG G-3’，產物大小205 bp)由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。兔抗人ADAM9抗體購自美國百奇公司。抗β-actin兔多克隆抗體、RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq MasterMix、哺乳動物蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。超敏ECL化學發光試劑盒BeyoECL Plus購自碧云天生物技術研究所。孔徑8 μm Transwell培養板購自康寧公司。基質膠購自BD Biosciences公司。

1.2實驗分組實驗分為4組。正常對照組：正常培養786-0細胞，不做處理。空脂質體轉染組：以體積分數0.2%的LipofectamineTM2000處理786-0細胞。陰性轉染組：用體積分數0.2%的LipofectamineTM2000及80 nmol/L的NC siRNA處理細胞。ADAM9 siRNA轉染組：用體積分數0.2%的LipofectamineTM2000及80 nmol/L的ADAM9-siRNA-2366處理細胞。

1.3細胞中ADAM9mRNA的檢測轉染24、48、72 h后收集各組細胞，提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，然后進行PCR。PCR條件：94 ℃預變性 2 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環;72 ℃終延伸2 min，4 ℃保存。以β-actin為內參。產物經30 g/L瓊脂糖凝膠電泳，EB染膠，用凝膠成像儀拍照，用ImageJ軟件對圖片進行數據分析。以ADAM9與β-actin條帶灰度值的比值表示ADAM9 mRNA的表達水平[4]。實驗重復3次。

1.4細胞中ADAM9蛋白的檢測各組細胞轉染48 h后，吸掉培養基，按哺乳動物蛋白提取試劑盒說明提取細胞總蛋白，按蛋白定量試劑盒Bradford比色法繪制蛋白定量標準曲線并測定蛋白質濃度。按SDS-PAGE凝膠制備試劑盒操作步驟配制SDS-PAGE凝膠。每孔上樣60 μg，濃縮膠80 V、分離膠120 V電泳約30 min。切膠,轉膜1～2 h,TBST洗膜，50 g/L脫脂奶粉封閉，一抗(ADAM9兔多克隆抗體稀釋100倍，內參β-actin抗體稀釋1 000倍)孵育過夜。TBST洗膜15 min×3次，HRP(抗兔)10 mL孵育4 h，漂洗3～5次，每次3 min。將超敏ECL化學發光試劑盒中A液、B液各0.5 mL混勻，暗環境下加到PVDF膜上，凝膠成像儀拍照，用Image J軟件對圖片進行數據分析。以ADAM9與β-actin條帶灰度值的比值表示ADAM9蛋白的表達水平[4]。實驗重復3次。

1.5細胞侵襲能力的測定各組細胞轉染48 h后，收集并計數，調整細胞密度均等。冰上融化基質膠，包被Transwell內室的基底膜。每組細胞設3個復孔。下室內為含體積分數10%胎牛血清的培養基，上室內為200 μL含低血清培養基的濃度相同的細胞懸液。孵育12 h后取出,擦去內表面的基質膠及未穿膜的細胞，多聚甲醛固定，蘇木素伊紅染色,鏡下觀察拍照, 每孔取3個視野(100倍)分別計數穿膜細胞數，取平均值，用穿膜細胞數代表細胞的侵襲能力[4]。

1.6統計學處理數據用SPSS 17.0處理，4組間ADAM9 mRNA、蛋白表達水平及穿膜細胞數的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組細胞ADAM9mRNA的表達見圖1及表1。ADAM9 siRNA轉染組細胞轉染24、48、72 h后，細胞中ADAM9 mRNA表達均明顯降低，以轉染48 h的沉默效果最好。

圖1 4組細胞ADAM9 mRNA的表達

1:DNA Marker；2:正常對照組；3:空脂質體轉染組；4:陰性轉染組；5、6:ADAM9 siRNA轉染組。

表1 4組細胞ADAM9 mRNA的表達

*：與其他3組比較，P<0.01。

2.2 4組細胞ADAM9蛋白的表達見圖2和表2。

圖2 4組細胞ADAM9蛋白的表達

M:Marker；1:正常對照組；2：空脂質體轉染組；3：陰性轉染組；4：ADAM9 siRNA轉染組。

2.3 4組細胞侵襲能力的比較見表2。ADAM9 siRNA轉染組穿膜細胞數較其他3組明顯減少。

表2 4組細胞ADAM9蛋白表達及穿膜細胞數的比較

*：與其他3組比較，P<0.01。

3 討論

RCCC是成年人腎臟最常見的惡性腫瘤，且近年來發病率呈增高趨勢。已經批準上市的分子靶向治療藥物有索拉非尼、舒尼替尼等，還有些腎癌靶向治療藥物正在研究中。靶向治療為不能手術切除的腎癌或晚期轉移腎癌的治療帶來了新的希望, 但這些治療普遍存在完全緩解率低、有一定的副作用等問題[5]。研究和發現新的更有效的RCCC診療作用靶點具有重要的意義。

ADAM9是去整合素金屬蛋白酶家族成員之一，研究證實ADAM9在多種腫瘤如乳癌[6]、結腸癌[7]、胰腺癌[8]等中高表達，并與腫瘤的進展侵襲等表型相關。體外研究[9]證實ADAM9基因沉默可抑制乳癌細胞的體外侵襲能力。抑制ADAM9的表達可誘導前列腺癌上皮細胞表型的改變，并增加人類前列腺癌細胞對放療和化療的敏感性[10]。ADAM9在非小細胞肺癌中的過度表達與腦轉移瘤相關[11]。去勢治療后的前列腺癌組織中ADAM9表達降低，并可作為一個良好的預后指標[12]。研究[3]還表明，ADAM9在腎細胞癌中高表達，并與腫瘤進展、淋巴結陽性狀態及腫瘤的遠處轉移相關。

該研究中作者采用RNAi技術體外沉默人RC-CC 786-0細胞ADAM9的表達，結果顯示ADAM9特異性siRNA能夠在mRNA水平和蛋白水平有效沉默786-0細胞中ADAM9基因的表達；同時Transwell侵襲性小室實驗結果顯示，ADAM9特異性siRNA轉染后的786-0細胞穿膜細胞數明顯減少。上述結果提示，ADAM9與786-0細胞的體外侵襲能力有關，ADAM9特異性siRNA能夠有效地沉默786-0細胞ADAM9的表達，并降低786-0細胞的體外侵襲能力。這為RCCC的靶向治療提供了新的研究思路。

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[2]孫飛達，王東文，米振國.腎癌分子靶向治療的現狀及研究進展[J].現代泌尿生殖腫瘤雜志,2012，4(1):1

[3]Fritzsche FR,Wassermann K,Jung M,et al.ADAM9 is highly expressed in renal cell cancer and is associated with tumour progression[J].BMC Cancer,2008,8:179

[4]鄭湘予，龐霞，李晟磊，等.siRNA干擾CXCR4基因對T24細胞侵襲力的影響[J].鄭州大學學報：醫學版,2012，47(5):667

[5]畢新剛，馬建輝.腎癌靶向治療現狀[J].臨床藥物治療雜志,2011，9(1):16

[6]O’Shea C,McKie N,Buggy Y,et al.Expression of ADAM-9 mRNA and protein in human breast cancer[J].Int J Cancer,2003,105(6):754

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(2013-04-11 收稿 責任編輯 王 曼)

Effect of ADAM9 targeted siRNA on ADAM9 gene expression and invasion capacity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells in vitro

ZHANGXinheng1),MAYaohui1),SHANZhongjie2)

1)OfficeforGraduateStudents,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang473003 2)DepartmentofUrology,thePeople’sHospitalofZhengzhouCity,Zhengzhou450003

renal clear cell carcinoma；a disintegrin and metalloprotease 9；invasion

Aim: To explore the effect of a disintegrin and metalloprotease 9(ADAM9) targeted siRNA on ADAM9 gene expression and invasion capacity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells. Methods:ADAM9 specific siRNA was designed and synthesized.786-0 cells were divided into 4 group:normal cultured group, LipofectamineTM2000 transfection group, unrelated sequence siRNA (NC siRNA)transfection group and ADAM9 specific siRNA transfection group. RT-PCR was applied to detect ADAM9 mRNA in 786-0 cells after transfection for 24,48,and 72 h.ADAM9 protein was detected by Western blot after transfection for 48 h， and cell invasion was detected with Transwell. Results: The expression of ADAM9 mRNA in ADAM9 specific siRNA transfection group after transfection for 24,48,and 72 h were lower(F=47.945，180.456,60.978，P<0.001),and ADAM9 protein expression and invasion capacity were significantly lower after transfection for 48 h(F=142.816,45.389，P<0.001).Conclusion: ADAM9 specific siRNA can silence ADAM9 gene in 786-0 cells and inhibit its invasion.

R737.11

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.016