應用免疫組織化學檢測EphA2及其調節基因HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達及相互關系

石棟梁，杜 濤，習國平(.河北省邯鄲市第三醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，河北 邯鄲 05600;.河北省邯鄲市第二醫院內窺鏡室，河北 邯鄲 05600)

·論著·

應用免疫組織化學檢測EphA2及其調節基因HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達及相互關系

石棟梁1，杜 濤2，習國平1
(1.河北省邯鄲市第三醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，河北 邯鄲 056001;2.河北省邯鄲市第二醫院內窺鏡室，河北 邯鄲 056001)

目的探討同源異形盒基因A1(homeobox genes A1,HoxA1)、癌基因(cancer-myc,C-myc)、促紅細胞生成素產生肝細胞受體A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2,EphA2)與喉癌發生發展的關系，從分子生物學角度探討喉癌的發病機制。方法40例喉癌組織及40例癌旁組織，取15例非喉癌患者的喉部正常黏膜組織做對照。所有腫瘤經病理檢查證實為鱗狀細胞癌，癌旁組織和正常組織取材經病理檢查證實為炎癥或正常。應用免疫組織化學檢測喉癌組織、癌旁組織及喉部正常黏膜組織中EphA2、HoxA1、C-myc陽性表達率。結果EphA2、HoxA1、C-myc在喉癌組織中的陽性表達率分別高于癌旁組織和正常喉黏膜組織，而癌旁組織與正常喉黏膜組織間的表達差異無統計學意義。結論EphA2蛋白、HoxA1蛋白、C-myc蛋白在喉癌中的表達與喉癌的發生、發展有關。

喉腫瘤；基因表達；免疫組織化學

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.009

喉癌的發生發展與多種癌調節基因及信號轉導通路的改變有關，其中促紅細胞生成素產生肝細胞受體A2(erythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2,EphA2)與癌細胞增殖、發展有關。同源異形盒基因A1(homeoboxgenesA1,HoxA1)作為細胞增殖分化的調節基因,不僅調控胚胎細胞的增殖和分化,而且也是成人組織細胞增殖和分化的重要調節基因；若HoxA1發生異常表達,就會導致個體發育和組織器官形成過程中出現異常的形態結構,并可致細胞惡性轉化形成腫瘤。癌基因(Cancer-myc,C-myc)屬于核蛋白類調控基因,其在細胞周期變化、細胞的生長代謝、基因的不穩定性、刺激血管生成、細胞惡性轉化、分化及凋亡中起重要的調節作用。EphA2的表達受到許多基因的調控。本研究從分子水平探討HoxA1、C-myc、EphA2與喉癌發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2006年8月—2013年8月河北省邯鄲市第三醫院經手術切除的喉癌組織40例及相應癌旁組織40例，非喉癌患者的喉部正常黏膜組織15例做對照。喉癌患者中男性37例，女性3例；年齡40～72歲，中位年齡56歲；所有腫瘤經病理檢查證實為鱗狀細胞癌，其中有淋巴結轉移者12例，無淋巴結轉移者28例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期24例，其中T1N0M0 6例，T2N0M0 10例，T2N1M0 2例，T2N2M0 1例，T3N0M0 9例，T3N1M0 2例，T3N2M0 6例，T4N0M0 3例，T4N2M0 1例。癌旁組織和正常黏膜組織取材經病理檢查證實為炎癥或正常。所有標本取材后立即用液氮冷藏保存。正常黏膜患者中男性8例，女性7例，年齡32～56歲，中位年齡41歲，均為聲帶息肉病。

1.2 方法：石蠟標本常規4μm連續切片，平鋪于載玻片上，放于60℃烤箱4h。浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10min。100%、90%、70%梯度酒精各5min，自來水沖洗，蒸餾水3min。3%H2O2及甲醇中室溫孵育15～20min，以消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水3min×3次，0.01mol/LPBS5min。抗原修復，EphA2、HoxA1、C-myc采用枸櫞酸鹽緩沖液高壓鍋加熱2min進行抗原修復。室溫冷卻30min，放入PBS內10min。吸去余液，擦凈載玻片。正常山羊或兔血清封閉，37℃濕盒內孵育40min。傾去血清，滴加EphA2、HoxA1、C-myc一抗，濃度按1∶100稀釋，4℃過夜。0.01mol/LPBS沖洗5min×3次。滴加第2代生物素標記的二抗工作液，37℃濕盒內孵育25min。0.01mol/LPBS沖洗5min×3次。滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃濕盒內孵育25min。0.01mol/LPBS沖洗5min×3次。DAB液顯色。蘇木精復染，常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察。

1.3 結果判定：EphA2和HoxA1判斷標準相同，陽性染色定位于細胞質。光鏡(10×40倍)下，隨機選擇5個視野，采用雙評分，按陽性細胞百分率評分，<10%為0分，≥10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分；按染色強度評分，無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。然后按陽性分乘以染色分計總分，總分為0判為“-”，總分<3分判為“+”，3～6分判為“++”，>6分判為“+++”。“+”～“+++”為陽性表達。

C-myc陽性定位于細胞質和細胞核。按染色強度和陽性細胞百分率評分，<10%為0分，≥10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分；按染色強度評分，無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分?？偡值扔?為陰性，總分1～2為弱陽性，總分3～4為陽性，總分>4為強陽性。

癌組織染色強度≥3或癌組織雖然染色強度=2但陽性細胞百分率≥10%皆歸為有表達，癌組織染色強度≤1，不論陽性率多大，皆歸為無表達。

由3位獨立觀察者閱片，根據其評分的平均值確定判定結果。

1.4 統計學方法：應用SPSS11.5統計軟件進行數據分析，計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

喉癌組織中EphA2蛋白、HoxA1蛋白和C-myc蛋白陽性表達率高于正常黏膜組織及癌旁組織(P<0.05)，而癌旁組織與正常黏膜組織比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 EphA2、Hoxa1和c-myc在癌組織及癌旁組織、正常黏膜組織中的表達Table 1 Expression of EphA2,HoxA1 and C-myc in laryngeal carcinoma,para-carcinoma tissues and normal mucosa tissues (n，%)

*P<0.05vsnormal mucosa tissues #P<0.05vspara-carcinoma tissues by χ2test

3 討 論

Eph受體是酪氨酸蛋白激酶受體家族中最大的分支，有對細胞增殖的調節作用。EphA2的過度表達具有轉化正常細胞的能力，當Eph-ephrin系統正常表達時可抑制細胞增生，異常表達時又可以促進細胞的轉化。Fujii等[1]將重組ephrinA1綁定到石川細胞的表面，而致EphA2及A4磷酸化。Hox基因不僅調控胚胎細胞的增殖和分化,而且也是成人組織細胞增殖和分化的重要調節基因。若Hox基因發生異常表達,就會導致個體發育和組織器官形成過程中出現異常的形態結構,并可致細胞惡性轉化形成腫瘤。C-myc原癌基因激活的主要方式是該基因的擴增和過表達,證明其在細胞周期變化、細胞的生長代謝、基因的不穩定性、刺激血管生成、細胞惡性轉化、分化及凋亡中起重要的調節作用。腫瘤細胞為了生長和轉移必須獲得血液供應，通常認為通過新生血管滿足其血液供應。

細胞遷移是腫瘤侵襲和轉移的重要環節，細胞與細胞外基質的黏附與解離是其必要的步驟。多種Eph受體及配體在腫瘤中尤其是腫瘤生長的高侵襲性階段有正調節作用。EphA2的過度表達不僅能導致正常細胞的惡性轉化，而且能增強腫瘤細胞向外侵襲的能力，這是通過削弱腫瘤細胞之間的連接，增加腫瘤細胞與細胞外基質成分的黏附和增強在基質的侵襲等方面實現的。任舒靈等[2]研究表明EphA2可降低鼻咽癌細胞對紫杉醇的藥物敏感性。

Karidis等[3]研究發現EphA2與甲狀腺腫瘤生成有關。EphA2的表達增高與疾病分期及預后都有一定關系，因此，EphA2可以作為一個獨立的診斷指標。Fujii等[4]采用印跡分析證實人類子宮內膜EphA2蛋白的存在。Brantley-Sieders等[5]研究表明EphA2在腫瘤新血管形成及侵襲轉移中起很重要的作用。Cheng等[6]研究表明，阻斷EphA2受體酪氨酸激酶可以抑制血管內皮生長因子誘導的血管生成。靳文劍等[7]研究表明肝細胞癌組織中EphA2蛋白表達上調,且其表達上調與肝癌的惡性病理特征及術后復發相關,提示EphA2蛋白可能在肝癌進展和轉移中發揮重要作用。

HoxA1可控制細胞周期，通過結合蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶1的催化亞基發揮作用。這種結合啟動G2停止期的非洲蟾蜍卵母細胞以及G2停止期、DNA受損的Jurket細胞(注：屬急性T細胞白血病細胞系)進入M期。Kang等[8]研究表明HoxA1在胃癌細胞的表達明顯高于癌旁正常黏膜上皮，成為胃癌DNA甲基化標記物之一。Tsou等[9]研究表明HoxA1在肺腺癌細胞中的超甲基化水平遠高于正常細胞(P<0.01)。但HoxA1在喉癌中的表達未見報道。

本研究結果與應用流式細胞術研究結論相似[10]。C-myc基因擴增量與C-myc蛋白表達量無關，C-myc蛋白表達在淋巴結陰性組中高于淋巴結陽性組可能是由于隨著腫瘤細胞的進展其mRNA變得更加不穩定所致。C-myc對EphA2的下調在乳腺上皮細胞中有效，而在癌細胞中EphA2對C-myc卻不敏感。C-myc和EphA2在喉癌中的因果關系以及其機制有待于進一步研究。本研究結果顯示EphA2和HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達情況，其可能參與腫瘤的惡性轉化過程，調節腫瘤細胞的增殖和分化，提示將來通過調節這些蛋白的表達可能在喉癌的臨床治療中有一定應用價值。

盡管關于喉癌的此類研究較少，但是我們推測EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表達變化與喉癌的發生、生長和轉移有關，其在喉癌組織中的表達情況可能預示癌細胞的侵襲與轉移，EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表達可能對判斷喉癌的惡性程度、病情進展有重要價值。

總之，喉癌細胞中EphA2和HoxA1、C-myc共同促進了喉癌的發生發展，為喉癌的診斷和治療提供了一個新的靶點。因此，深入研究EphA2和HoxA1、C-myc的生物學作用及其作用機制，進而選擇最佳靶位，可能為封閉、阻斷喉癌的發生發展提供更有力的依據。

[1] FUJII H,FUJIWARA H,HORIE A,et al.EphrinA1 stimulates cell attachment and inhibits cell aggregation through the EphA receptor pathway in human endometrial carcinoma-derived Ishikawa cells[J].Hum Reprod,2011，26(5):1163-1170.

[2] 任舒靈，劉勇，李果，等.EphA2 蛋白調控鼻咽癌紫杉醇敏感性的實驗研究[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志,2013,19(1):28-31,37.

[3] KARIDIS NP,GIAGINIS C,TSOUROUFLIS G,et al.Eph-A2 and Eph-A4 expression in human benign and malignant thyroid lesions: an immunohistochemical study[J].Med Sci Monit,2011，17(9):257-265.

[4] FUJII H,FUJIWARA H,HORIE A,et al.Ephrin A1 induces intercellular dissociation in ishikawa cells: possible implication of the Eph-ephrin A system in human embryo implantation[J].Hum Reprod,2011，26(2):299-306.

[5] BRANTLEY-SIEDERS DM,FANG WB,HICKS DJ,et al.Impaired tumor microenvironment in EphA2-deficient mice inhibits tumor angiogenesis and metastatic progression[J].FASEB J,2005,19 (13):1884-1886.

[6] CHENG N,BRANTLEY DM,LIU H,et al.Blockade of EphA receptor tyrosine kinase activation inhibits vascular endothelial cell growth factor-induced angiogenesis[J].Mol Cancer Res,2002,1(1):2-11.

[7] 靳文劍，張焜和，陳火國，等.EphA2在肝細胞癌中的表達及臨床意義[J].重慶醫學,2013,42(20):2361-2363.

[8] KANG GH,LEE S,CHO NY,et al.DNA methylation profiles of gastric carcinoma characterized by quantitative DNA methylation analysis[J].Lab Invest,2008,88(2):161-170.

[9] TSOU JA,GALLER JS,SIEGMUND KD,et al.Identification of a panel of sensitive and specific DNA methylation markers for lung adenocarcinoma[J].Mol Cancer,2007,6:70.

[10] 石棟梁,杜濤,習國平.應用流式細胞術檢測EphA2及其調節基因HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達及相互關系[J].河北醫科大學學報,2013,34(3):294-297.

(本文編輯：趙麗潔)

EXPRESSIONANDRELATIONSOFEphA2,HoxA1ANDC-mycINLARYNGEALCARCINOMAWITHIMMUNOHISTOCHEMICALSTAINING

SHIDongliang1,DUTao2,XIGuoping1
(1.DepartmentofOtolaryngology,theThirdHospitalofHandan,HebeiProvince,Handan056001,China;2.EndoscopyRoom,theSecondHospitalofHandan,HebeiProvince,Handan056001,China)

ObjectiveThestudyexploredtherelationofhomeoboxgenesA1(HoxA1),cancer-myc(C-myc)anderythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2(EphA2)withlaryngealcarcinomaforthegenesismechanismoflaryngealcarcinomaatthelevelofmolecularbiology.MethodsFortylaryngealcarcinomafreshsampleswereanalyzedandmeanwhile40para-carcinomatissuesand15normallaryngealmucosasampleswerealsostudiedascontrols.Alltumortissueswereconfirmedtobesquamous-cellcarcinoma;thepara-carcinomatissuesandnormalmucosawereconfirmedtobeinflammatoryornormalmucosapathologically.TheexpressionofEphA2,HoxA1andC-mycproteinweremeasuredinlaryngealcarcinoma,para-carcinomatissuesandnormallarynnealmucosatissueswiththeimmunohistochemicalstaining.ResultsTheexpressionsofEphA2,HoxA1,C-mycinlaryngealcarcinomatissuesweresignificantlyhigherthanthoseofpara-carcinomaandinnormallaryngealmucosatissues,respectively.Therewasnosignificantdifferencebetweentheexpressionsofpara-carcinomaandnormallaryngealmucosatissues.ConclusionTheexpressionsofEphA2,HoxA1andC-myccontributetothecarcinogenesisanddevelopmentoflaryngealcarcinoma.

laryngealneoplasms；geneexpression；immunohistochemistry

2013-10-15；

2014-02-12

石棟梁(1971-)，男，河北魏縣人,河北省邯鄲市第三醫院主治醫師，醫學碩士，從事耳鼻咽喉頭頸外科疾病診治研究。

R739.65

A

1007-3205(2014)09-1018-04