丁苯酞對彌漫性顱腦損傷大鼠腦水腫及p38MAPK表達的影響

劉永亮，王麗娟，王麗娜，李建民，趙雅寧，王 鵬(.河北省唐山市人民醫院神經外科，河北 唐山 06000；.河北省唐山市豐潤區第二人民醫院檢驗科，河北 唐山 0600；.河北聯合大學附屬醫院神經外科，河北 唐山 06000)

·論著·

丁苯酞對彌漫性顱腦損傷大鼠腦水腫及p38MAPK表達的影響

劉永亮1，王麗娟2，王麗娜1，李建民3，趙雅寧3，王 鵬1
(1.河北省唐山市人民醫院神經外科，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市豐潤區第二人民醫院檢驗科，河北 唐山 063030；3.河北聯合大學附屬醫院神經外科，河北 唐山 063000)

目的探索丁苯酞對彌漫性顱腦損傷大鼠腦水腫及大腦皮層p38MAPK表達的影響。方法健康雄性SD大鼠144只，隨機分為假手術組、對照組和丁苯酞組。對照組和丁苯酞組參考Mormarou法自由落體打擊建立大鼠彌漫性顱腦損傷模型。丁苯酞組于大鼠模型制造成功后30min給予80mg/kg丁苯酞軟膠囊植物油溶液灌胃，1次/d，連續用藥至1、2、7、14d 4個時間點。假手術組和對照組于相同時間點給予等量植物油。各組于術后1、2、7、14d 4個時間點行神經功能學評分檢測行為學變化；干濕質量法觀察3組大鼠腦組織含水量的變化；免疫組織化學法觀察3組大鼠p38MAPK表達的變化。結果與假手術組比較，對照組神經功能評分降低，腦組織含水量增加，p38MAPK陽性細胞細胞表達數量增加(P<0.05)；與對照組比較，丁苯酞組神經功能評分增加，腦組織含水量降低，p38MAPK陽性細胞表達數量減少(P<0.05)。結論丁苯酞對彌漫性顱腦損傷大鼠有保護作用，同時可以減少p38MAPK的陽性表達。

腦損傷；腦水腫； p38絲裂原活化蛋白激酶類；丁苯酞

顱腦創傷是臨床常見的一類疾病，隨著交通運輸業的發展，交通事故越來越多，顱腦創傷的發生率和致死率不斷增加。丁苯酞是我國自行研制的一類治療缺血性腦血管病的新藥，對急性腦梗死有明顯的治療作用。而有關丁苯酞對顱腦創傷的影響尚未見臨床報道，本研究觀察丁苯酞對顱腦創傷大鼠腦水腫及皮層p38MAPK表達的影響，旨在為丁苯酞在顱腦創傷中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 動物來源：清潔SD雄性大鼠144只(購自北京維通利華公司)，體質量(320±20)g，維持室溫在20～25℃，正常飲食飲水，飼養2～3周后進行實驗。

1.2 方法：按照隨機數字表法將144只大鼠分為假手術組、對照組和丁苯酞組，每組分為1、2、7、14d4個時間點。每個時間點4只。行為評分用48只，腦組織含量用48只，免疫組織化學用48只。參照Marmarou等[1]的方法制作彌漫性顱腦損傷模型。對照組和丁苯酞組術前12h禁食水，采用吸入性麻醉的方法，剪去大鼠顱頂毛發，常規消毒，沿中線失狀縫切開頭皮，暴露顱骨頂部，剝離骨膜，大鼠冠狀縫與失狀縫正中放置不銹鋼墊，俯臥位固定于海綿床墊上。待動物開始蘇醒、有肢體活動時，質量450g的銅棒在垂直塑料管中從1.2m高度自由落下擊中不銹鋼墊，造成大鼠彌漫性顱腦創傷。丁苯酞組大鼠致傷后30min給予丁苯酞軟膠囊植物油溶液，藥物劑量按80mg/kg灌胃，1次/d，直至各時間點處死。對照組給予等量植物油。假手術組僅給予麻醉及頭皮切開、縫合，但不致傷。

1.3 行為學檢測：參照Chen等[2]的神經功能缺失評分量表(neurologicalseverityscores,NSS)，對3組大鼠在1、2、7、14d時間點進行神經功能行為學檢測。

1.4 采用干濕質量法測量腦組織含水量：參照Yang等[3]的實驗方法，將3組不同時間點的大鼠，開顱取出腦組織后，用過濾紙將其表面的液體擦干，將腦組織放置于烘烤過的載玻片上，準確測量得到腦組織的質量即濕質量。隨即將腦組織放入110℃烤箱中24h，測得到的質量即為干質量。腦組織含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

1.5 免疫組織化學：參照免疫組織化學試劑盒步驟進行實驗。采用陽性細胞計數法，在相同光鏡倍數(10×40)下每只大鼠每個指標選取5張腦組織切片，每張切片在高倍視野鏡下隨機選取5個不重疊視野，計算每個視野的陽性細胞數及棕黃色顆粒細胞，取均數作為每組該指標陽性細胞數。

2 結 果

2.1 神經功能評分結果：與假手術組比較，對照組大鼠神經功能評分下降(P<0.05)；與對照組比較，丁苯酞組大鼠神經功能評分提高(P<0.05)。并隨著時間延長，行為學評分越來越高，丁苯酞組14d與各時間點和對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

GroupsBehaviorscores1d2d7d14dFPSham18．01±0．0218．01±0．0218．01±0．0218．01±0．02--Control7．00±0．82?9．25±0．50?△13．25±0．96?△☆15．75±0．96?△☆▲89．7880．000Butylphthalide8．75±0．96?#11．25±0．96?#△14．75±0．50?#△☆17．00±1．41△☆▲52．4690．000 F265．234216．67260．8975．273 P0．0000．0000．0000．000

*P<0.05vssham #P<0.05vscontrol △P<0.05vs1d ☆P<0.05vs2d ▲P<0.05vs7d byqtest

2.2 腦組織含水量結果：與假手術組比較，對照組傷后腦組織含水量增加(P<0.05)。對照組和丁苯酞組腦組織水含量均在7d達高峰，14d明顯下降，丁苯酞組14d與2、7d和對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

GroupsBrainwatercontent1d2d7d14dFPSham71．5±0．871．5±1．171．6±1．071．7±1．00．0360．990Control78．8±1．2?81．4±1．1?△82．1±0．8?△76．4±0．9?△☆▲34．0310．000Butylphthalide73．6±1．0?#78．9±0．9?#△79．6±0．9?#△74．0±0．9?#☆▲59．2210．000 F65．338126．058183．77034．030 P0．0000．0000．0000．000

*P<0.05vssham #P<0.05vscontrol △P<0.05vs1d ☆P<0.05vs2d ▲P<0.05vs7d byqtest

2.3 p38MAPK陽性細胞免疫組織化學： 假手術組大鼠皮層可以觀察到有少量磷酸化；對照組皮層均有不同程度磷酸化，陽性細胞染色呈現棕黃色顆粒狀，主要分布于細胞核；丁苯酞組的磷酸化p38MAPK陽性細胞數量表達均較對照組少，陽性細胞染色呈現棕黃色顆粒狀，主要分布于細胞核。

假手術組p38MAPK陽性細胞表達各時間點差異無統計學意義(P>0.05)。對照組和丁苯酞組p38MAPK陽性細胞表達在7d達高峰，14d明顯下降，丁苯酞組14d均較2、7d和對照組明顯下降(P<0.05)。見表3。

Groupsp38MAPKpositivecells1d2d7d14dFPSham2．60±1．1402．20±0．4472．40±0．5482．40±0．8940．2050．891Control11．80±1．924?15．60±1．140?△16．80±0．837?△13．20±0．837?☆▲16．0310．000Butylphthalide7．40±1．517?#11．80±1．304?#△13．40±1．342?#△8．60±1．517?#☆▲19．0620．000 F43．507223．562303．500115．947 P0．0000．0000．0000．000

*P<0.05vssham #P<0.05vscontrol △P<0.05vs1d ☆P<0.05vs2d ▲P<0.05vs7d byqtest

3 討 論

隨著社會現代化進程的快速推進，特別是交通運輸業的迅猛發展，創傷性腦損傷的發生率日趨增高。其致殘率和病死率較高，嚴重危害人們的身心健康，給社會和家庭帶來沉重的負擔。目前針對創傷性腦損傷的研究逐步深入，但其確切發生發展機制尚未完全清楚。

研究[4]表明丁苯酞具有多種藥理作用。丁苯酞可提高腦血管內皮一氧化氮和前列腺環素的水平，通過抑制血清高敏C反應蛋白的表達[5]，抑制基質金屬蛋白酶9的表達和血尿屏障通透性的增高[6]，降低細胞內鈣濃度，抑制谷氨酸釋放，降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等機制阻斷急性腦梗死所致腦損傷的多個病理環節，從而發揮較強的抗腦缺血作用，改善神經系統功能[7]。

p38MAPK相對分子質量為38 000，最初被認為是一種能被脂多糖激活的激酶[8]。p38MAPK信號傳導通路可由腦缺血再灌注損傷、滲透壓變化和病理應激刺激等情況下激活，在多種神經系統疾病如腦損傷的發生發展過程中，細胞凋亡和炎癥反應中均發揮重要作用[9-10]。炎性因子、應激刺激(紫外線、高滲透壓、熱休克)、脂多糖、過氧化氫、谷氨酸等均可激活p38MAPK信號通路[11]。

谷氨酸作用產生的興奮毒性能夠引起細胞因子的迅速表達和p38MAPK的快速激活。谷氨酸與中樞神經系統的NMDAR結合后可激活p38MAPK，導致腦顆粒細胞發生凋亡[8]。

本實驗通過丁苯酞的干預作用，大鼠神經功能評分得以提高，腦水腫情況減輕，從而發揮了對彌漫性顱腦損傷大鼠的保護作用。而且在p38MAPK陽性結果表達中可以看出，用藥之后p38MAPK陽性細胞表達數量是減少的，說明丁苯酞抑制了p38MAPK的表達，但其確切抑制機制值得進一步研究。

針對彌漫性顱腦損傷的發生率和致殘致死率，進一步深入研究創傷性腦損傷發病機制及其傷后病理生理變化、尋求更加有效的治療途徑，將有助于提高患者的生存率，改善患者的生存質量。

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(本文編輯：許卓文)

EFFECTOFBUTYLPHTHALIDEONBRAINEDEMAOFRATSAFTERFOCALCEREBRALINFARCTIONANDEXPRESSIONOFp38MAPK

LIUYongliang1，WANGLijuan2，WANGLina1，LIJianmin3，ZHAOYaning3，WANGPeng1
(1.DepartmentofNeurosurgery,TangshanPeople'sHospital,HebeiProvince,Tangshan063000,China;2.DepartmentofLaboratory,FengrunSecondPeople′sHospital,TangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063030,China;3.DepartmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospitalofHebeiUnitedUniversity,HebeiProvince,Tangshan063000,China)

ObjectiveToexploretheeffectofbutylphthalideonthebrainedemaofratsfollowingtraumaticbraininjuryandtheexpressionofp38MAPKaroundtheinjuryarea.Methods144Sprague-Dawleymaleratsweredividedintoshamgroup,controlgroupandbutylphthalidegroup(40mg/kg，onceaday).ThemodelwasmadebyMarmaroumethod.Afterinjury1,2,7,14d,behaviorscoresweredonetoobservethechangesofneuromotorfunction,brainwatercontentwasmeasuredtoobservethechangesofthebrainedema,theimmunohistochemistryandwesternblotweredonetolooktheexpressionofp38MAPKaroundtheinjuryarea.ResultsComparedwiththeshamgroup,thebehaviorscoresofcontrolgroupweredecreased,thebrainwatercontentofthecontrolgroupwasmore,thecontentofp38MAPKaroundtheinjuryareawasincreased(P<0.05).Comparedwiththecontrolgroup,thebehaviorscoresofbutylphthalidegroupwereincreased,thebrainwatercontentofthebutylphthalidegroupwasless,thecontentofp38MAPKaroundtheinjuryareaofbutylphthalidegroupwasdecreased(P<0.05).ConclusionButylphthalidecouldreducetheexpressionofp38MAPKfollowingtraumaticbraininjuryandreducethebrainedema.

braininjury;brainedema;p38mitogen-activatedproteinkinases;butylphthalide

2013-11-18；

2014-02-14

河北省衛生廳科研基金項目(20130384)

劉永亮(1974-)，男，河北唐山人，河北省唐山市人民醫院副主任醫師，醫學碩士，從事神經外科疾病診治研究。

R651.15

A

1007-3205(2014)06-0631-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.06.005