重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對類風濕關節炎患者外周血Fas系統的影響

夏晨輝，吳曉巖，彭晨星，魏偉華，韓玉祥，靳洪濤，郭惠芳(.哈勵遜國際和平醫院藥學部，河北 衡水 05000；.河北醫科大學第二醫院藥學部，河北 石家莊 050000；.河北醫科大學第二醫院免疫風濕科，河北 石家莊 050000；.河北省任丘市人民醫院內科，河北 任丘 06550)

·論著·

重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對類風濕關節炎患者外周血Fas系統的影響

夏晨輝1，吳曉巖2，彭晨星3*，魏偉華4，韓玉祥3，靳洪濤3，郭惠芳3
(1.哈勵遜國際和平醫院藥學部，河北 衡水 053000；2.河北醫科大學第二醫院藥學部，河北 石家莊 050000；3.河北醫科大學第二醫院免疫風濕科，河北 石家莊 050000；4.河北省任丘市人民醫院內科，河北 任丘 062550)

目的通過檢測類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)患者在應用注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(recombinant human tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein，rhTNFR∶Fc)治療前后外周血T淋巴細胞Fas/Fas L水平的變化情況，了解rhTNFR∶Fc對RA患者外周血T淋巴細胞凋亡的影響。方法RA患者64例為治療組，并隨機分為3個亞組，甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)組17例，rhTNFR∶Fc組25例，MTX+rhTNFR∶Fc治療組22例；并選擇正常體檢者18例作為對照組。各組分別抽取rhTNFR∶Fc治療前后靜脈血檢測Fas/Fas L的水平，記錄所有RA患者28個關節的關節壓痛數、關節腫脹數，檢測紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR，魏氏法)、類風濕因子(rheumatoid factor,RF-IgM，比濁法)，并計算28個關節疾病活動指數(disease activity score 28,DAS28)。結果各組RA患者治療前外周血中關節壓痛數、關節腫脹數、ESR、RF、DAS28、Fas、Fas L、Fas/Fas L水平均比正常對照組明顯增高，治療后各指標均明顯下降，其中MTX+rhTNFR∶Fc組較其余2組更為顯著(P<0.01)。RA患者在接受rhTNFR∶Fc治療后，Fas/Fas L與ESR、RF、DAS28呈正相關(r=0.441、0.527、0.466，P<0.01)。結論rhTNFR∶Fc可以通過抑制活化的T淋巴細胞分泌腫瘤壞死因子α，下調RA外周血淋巴細胞Fas系統的表達，最終達到抗風濕的作用。

關節炎，類風濕；受體，腫瘤壞死因子，Ⅱ型；T淋巴細胞

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以持續的滑膜炎、多關節骨與軟骨破壞為特征的系統性自身免疫性疾病。外周血T淋巴細胞的凋亡在RA發病機制中占有非常重要的地位[1]。細胞凋亡是一種由基因控制的細胞自主性死亡方式，Fas系統是引起細胞凋亡的主要途徑之一。Fas屬于腫瘤壞死因子/神經生長因子受體家族成員，廣泛分布于活化的T、B淋巴細胞，某些上皮細胞和腫瘤細胞中也有表達。Fas L是Fas在人體內的天然配體,Fas和Fas L相互作用是誘導細胞凋亡的重要途徑，當Fas與Fas L結合時，將信號傳遞到胞質區，致Fas的死亡域結構活化，介導表達Fas的細胞凋亡[2]。注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(recombinant human tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein，rhTNFR∶Fc)可競爭性地與血中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)結合，阻斷其與細胞表面TNF-α受體結合，降低其活性，是治療RA的新一代改善病情藥物。本研究擬通過檢測RA患者在應用rhTNFR∶Fc治療前后外周血T淋巴細胞Fas/Fas L水平的變化情況，了解rhTNFR∶Fc對RA患者外周血T淋巴細胞凋亡的影響，探討其治療RA的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2012年1月—2013年11月在河北醫科大學第二醫院確診的RA患者64例為治療組，均符合美國風濕病協會1987年修訂的RA診斷標準，男性16例，女性48例；年齡19～53歲，平均(35.2±10.5)歲；病程1.2～8.7年，平均(3.5±1.3)年。并選擇體檢中心體檢的健康志愿者18例為對照組，男性6例，女性12例；年齡20～51歲，平均(32.6±7.4)歲；需詢問病史、體格和常規生化檢查、心電圖和正位胸部X線片等輔助檢查，無器質性疾病，而且既往無RA及其他自身免疫性疾病。2組性別、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。治療組隨機分為3個亞組，甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)組17例，rhTNFR∶Fc組25例，MTX+rhTNFR∶Fc組22例。研究符合醫院人體試驗倫理委員會所制定的倫理學標準并得到該委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。MTX組口服MTX10mg/次，每周1次，共用12周；rhTNFR∶Fc組皮下注射rhTNFR∶Fc 25mg/次，每周2次，共用12周；MTX+rhTNFR∶Fc組為上述2種藥物聯合應用，劑量同上，共用12周。

1.2 試劑與儀器：注射用rhTNFR∶Fc(商品名益賽普，批準文號S20050058，12.5mg/支)購于上海中信國建制藥有限公司，注射用MTX(10mg/支)購于上海華聯制藥有限公司，PE-Fas及PE-Fas L購于美國CALTAG公司，FITC-IgG1及PE-Ig G2α購于美國Pharmigen公司，RF試劑盒均購于歐蒙(杭州)醫學實驗診斷有限公司，細胞培養箱(美國Forma公司，TNZ1FORMA3111)，流式細胞儀(美國BD公司，FACS Calibur)。

1.3 方法：收集所有受試者肝素抗凝靜脈血0.5～1.0mL。在流式專用試管內加入抗Fas單抗-PE、抗Fas L單抗-PE及同型對照IgG2a PE各10μL，然后加入50μL抗凝全血混勻，室溫避光反應20min。加入溶血素溶血500μL，渦旋混勻，室溫避光12min，反應完畢后用PBS洗滌1次，加PBS 3mL。離心機1 000r/min離心5min，棄上清液，留沉淀上機檢測。以Cellquest軟件進行樣本的攝取及分析，共記錄10 000個細胞。圈定淋巴細胞群進行Fas及Fas L分析。結果以雙參數散點圖(dot plot)顯示，由流式細胞儀附帶軟件處理給出結果。

1.4 觀察指標：分別抽取RA患者rhTNFR∶Fc治療前后靜脈血檢測Fas/Fas L的水平，記錄RA患者28個關節(28個關節包括腕、肘、肩、膝關節各2個，雙手近指關節及掌指關節各10個)的關節壓痛數、關節腫脹數，檢測紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR，魏氏法)、類風濕因子(rheumatoid factor,RF-IgM，比濁法)，并計算28個關節疾病活動指數(disease activity score 28,DAS28)。DAS28包括人體28個關節的壓痛計數、腫脹計數、ESR的水平以及患者的自身綜合評估(最近7d患者RA病情活動性，用0～100mm表示，數值越大，活動性越大)。DAS28=0.56×SQRT(T28)+0.28×SQRT(SW28)+0.70×LN(ESR)+0.014×GH。

2 結 果

2.1 脫落病例和不良反應：治療組共完成試驗59例，脫落5例，其中MTX組2例，rhTNFR∶Fc組1例，MTX+rhTNFR∶Fc組2例。共發生不良事件4例，無嚴重不良事件發生，其中MTX組2例[1例為白細胞減低(3.31×109/L)，1例為肝功能損傷(丙氨酸轉氨酶62U/L，天冬氨酸轉氨酶56U/L)]，rhTNFR∶Fc組1例為皮膚注射處紅腫，MTX+rhTNFR∶Fc組1例為白細胞減低(3.2×109/L)。各組不良反應均未影響本試驗研究。

2.2 4組觀察指標比較：3個亞組患者治療前關節壓痛數和關節腫脹數差異無統計學意義，治療后MTX+rhTNFR∶Fc組關節壓痛數明顯少于MTX組和rhTNFR∶Fc組(P<0.05)；關節腫脹數rhTNFR∶Fc組少于MTX組(P<0.05)，MTX+rhTNFR∶Fc組少于rhTNFR∶Fc組(P<0.01)；治療前3個亞組ESR、RF、DAS28、Fas、Fas L和Fas/Fas L均高于對照組(P<0.05)，而3個亞組之間差異無統計學意義，治療后3個亞組ESR、RF、DAS28、Fas、Fas L和Fas/Fas L較治療前均明顯降低(P<0.05)；3個亞組各指標較正常對照組有升有降，但最接近正常對照組的是MTX+rhTNFR∶Fc組組，其次和rhTNFR∶Fc組。見表1。

2.3 相關分析：RA患者在接受rhTNFR∶Fc治療后，Fas/Fas L與ESR、RF、DAS28呈正相關，差異有統計學意義(r=0.441、0.527、0.466，P<0.01)。

組別例數關節壓痛數(個)治療前治療后關節腫脹數(個)治療前治療后正常對照組180000MTX組159．67±2．155．37±1．94☆6．13±1．543．96±1．45☆rhTNFR∶Fc組249．17±2．415．19±2．04☆5．42±1．583．18±1．57#☆MTX+rhTNFR∶Fc組209．65±2．513．68±2．17#△☆5．85±1．352．19±1．26△☆ F值0．2993．9161．1134．452 P值0．7420．0260．3360．016組別例數ESR(mm/1h)治療前治療后RF(kU/L)治療前治療后正常對照組187．56±3．737．56±3．734．32±2．294．32±2．29MTX組1554．87±13．34?22．54±15．97?☆245．81±82．14?131．27±63．52?☆rhTNFR∶Fc組2449．12±12．69?22．78±17．83?☆276．43±93．55?124．58±72．49?☆MTX+rhTNFR∶Fc組2052．62±12．17?15．82±11．16☆235．12±85．67?76．62±59．57?#△☆ F值71．8025．42549．44118．464 P值0．0000．0020．0000．000組別例數DAS28治療前治療后Fas(%)治療前治療后正常對照組181．41±1．331．41±1．3319．35±5．2619．35±5．26MTX組156．24±2．26?3．31±1．43?☆54．38±7．86?4．32±8．54?☆rhTNFR∶Fc組245．63±1．94?3．46±1．37?☆51．47±8．29?23．63±7．47?☆MTX+rhTNFR∶Fc組205．76±2．25?2．05±1．06?#△☆53．52±8．62?16．58±8．11#△☆ F值23．35812．1687．8185．254 P值0．0000．0000．0000．002組別例數FasL(%)治療前治療后Fas/FasL治療前治療后正常對照組181．53±0．661．53±0．6612．26±3．4712．26±3．47MTX組153．45±0．78?1．88±0．64☆22．78±2．96?13．63±2．57?☆rhTNFR∶Fc組243．74±0．85?1．92±0．73☆24．48±3．38?14．21±3．13?☆MTX+rhTNFR∶Fc組203．66±0．74?1．35±0．67△☆24．52±3．24?9．58±2．06?#△☆ F值35．2123．31960．21616．633 P值0．0000．0240．0000．000

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與MTX組比較 △P<0.05與rhTNFR∶Fc組比較 ☆P<0.05與治療前比較(q檢驗或配對t檢驗)
MTX：methotrexate；rhTNFR∶Fc：recombinant human tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein；ESR：erythrocyte sedimentation rate；RF：rheumatoid factor；DAS28：disease activity score 28

3 討 論

抗原通過抗原提呈細胞激活T細胞，致炎性細胞因子等炎癥介質產生增多，進而引起滑膜炎、血管炎、軟骨及骨破壞等RA的特征性病理變化。淋巴細胞凋亡在RA發病過程中的變化有助于進一步明確其發病機制[3]。隨著RA生物技術的進展和對發病機制的研究，出現了生物慢作用抗風濕藥，生物制劑可以抑制促炎因子，在炎癥過程中發揮關鍵作用。TNF-α抑制劑在改善臨床療效及生活質量、實現RA的低疾病活動度和目標治療方面有著非常突出的優勢[4-5]。

本研究結果顯示，rhTNFR∶Fc能夠下調外周血淋巴細胞Fas、Fas L水平，并且與MTX作用相當，二者聯用可以增加其調控Fas系統的作用，同時也明顯改善關節腫脹及壓痛數、ESR、RF、DAS28等炎癥指標的水平，緩解RA的臨床癥狀。

Fas系統可以誘導機體免疫細胞凋亡，是一種主動的、生理的細胞死亡方式，是機體清除活化的淋巴細胞，保證細胞群體數量穩態、維持免疫系統功能的重要手段。RA患者外周血淋巴細胞活化后可以產生多種炎癥因子如TNF-α、白細胞介素4等，刺激滑膜產生炎癥，生成滑膜血管翳，是造成關節破壞、畸形及功能障礙的病理基礎。Chou等[6]發現在RA患者中Fas/Fas L的水平較骨關節炎患者明顯升高。Cha等[7]和García等[8]研究表明，滑膜細胞凋亡障礙可以導致滑膜細胞增殖和凋亡間平衡失調，引起RA關節滑膜組織過度增生，進而導致受累關節炎癥、功能減退及畸形。Fas系統對RA發病的影響以及給予慢作用抗風濕藥后可以改善其對RA的誘導[9-10]。

TNF-α是RA、銀屑病、強直性脊柱炎等病理過程中的一個主要炎性介質，其參與調控的炎癥反應可導致關節的病理改變。rhTNFR∶Fc是新一代的生物制劑抗風濕藥物，隨著近年來的廣泛應用，對其影響細胞凋亡方面也有許多研究。Gorak-Stolinska等[11]證實，rhTNFR∶Fc可以抑制Fas介導的細胞凋亡，從而增加人原效應T細胞易感性并進一步活化誘導細胞死亡，而且Th1和Tc1的細胞比Th2細胞更易發生死亡，其機制可能是抑制了參與炎癥介質分泌的一種端粒酶。Fries等[12]研究rhTNFR∶Fc對實驗性結腸炎小鼠腸黏膜上皮細胞凋亡的早期影響，發現rhTNFR∶Fc可以抑制回腸黏膜上皮Fas L的表達，而抗凋亡蛋白Bcl-2水平則在疾病早期即出現快速升高，證實其可能通過抑制外周循環TNF-α水平來達到抑制凋亡的作用。Mazzon等[13]評估TNF-α對TNF-α受體1基因敲除小鼠炎性疾病的發病機制時發現，TNF-αR1KO小鼠顯著減少炎癥部位滲出液的積聚和炎癥細胞的數量，同時Fas L也顯著降低，并且對炎癥小鼠注射rhTNFR∶Fc后同樣達到降低Fas L、抑制細胞凋亡的作用。總之，rhTNFR∶Fc可以通過抑制活化的T淋巴細胞分泌TNF-α，通過某種調控來下調RA外周血淋巴細胞Fas系統的表達，最終達到抗風濕的作用。

近期的研究[14]表明，rhTNFR∶Fc不管是單用還是與MTX聯用，都非常安全和有效，隨著對其作用機制的進一步明確，必將在RA治療中得到更好的應用。

[1] SALMON M,SCHEEL-TOELLNER D,HUISSOON AP,et al.Inhibition of T cell apoptosis in the rheumatoid synovium [J].J Clin Invest,1997,99(3):439-446

[2] REICHMANN E.The biological role of the Fas/FasL system during tumor formation and progression [J].Semin Cancer Biol,2002,12(4):309-315.

[3] EMERY P,GABAY C,KRAAN M,et al.Evidence-based review of biologic markers as indicators of disease progression and remission in rheumatoid arthritis[J].Rheumatol Int,2007,27(9):793-806.

[4] ABALOS MEDINA GM,RUIZ VILLAVERDE G,SNCHEZ CANO D,et al.The impact of therapy with TNF-blockers on health-related quality of life in rheumatoid arthritis patients.A pilot study[J].Reumatol Clin,2011,7(3):167-171.

[5] NGUYEN CM,BOUNTHAVONG M,MENDES MA,et al.Cost utility of tumour necrosis factor-α inhibitors for rheumatoid arthritis:an application of Bayesian methods for evidence synthesis in a Markov model [J].Pharmacoeconomics,2012,30(7):575-593.

[6] CHOU CT,YANG JS,LEE MR.Apoptosis in rheumatoid arthritis--expression of Fas,Fas-L,p53,and Bcl-2 in rheumatoid synovial tissues [J].J Pathol,2001,193(1):110-116.

[7] CHA HS,BAE EK,AHN JK,et al.Slug suppression induces apoptosis via Puma transactivation in rheumatiod arthris fibroblast-like synoviocytes treated with hydrogen peroxide[J].Exp Mol Med,2010,42(6):428-436.

[9] 彭晨星,邵福靈,劉鳳珍,等.類風濕關節炎外周血淋巴細胞Th1/Th2和Fas/Fas L的表達及相關性研究[J].臨床薈萃,2005,20(18):1063-1064.

[10] 彭晨星,趙志明,翟素巧,等.來氟米特對活動期類風濕關節炎外周血Fas系統的影響[J].臨床薈萃,2008,23(9):662-663.

[11] GORAK-STOLINSKA P,TRUMAN JP,KEMENY DM,et al.Activation-induced cell death of human T-cell subsets is mediated by Fas and granzyme B but is independent of TNF-alpha [J].J Leukoc Biol,2001,70(5):756-766.

[12] FRIES W,MUJA C,CRISAFULLI C,et al.Infliximab and etanercept are equally effective in reducing enterocyte APOPTOSIS in experimental colitis [J].Int J Med Sci,2008,5(4):169-180.

[13] MAZZON E,ESPOSITO E,DI PAOLA R,et al.Effect of tumour necrosis factor-alpha receptor 1 genetic deletion on carrageenan-induced acute inflammation:a comparison with etanercept[J].Clin Exp Immunol,2008,153(1):136-149.

[14] MORELAND LW,O′DELL JR,PAULUS HE,et al.A randomized comparative effectiveness study of oral triple therapy versus etanercept plus methotrexate in early aggressive rheumatoid arthritis:the treatment of Early Aggressive Rheumatoid Arthritis Trial [J].Arthritis Rheum,2012,64(9):2824-2835.

(本文編輯：趙麗潔)

2014-03-12；

2014-04-11

河北省衛生廳醫學重點科研計劃(20110356)

夏晨輝(1972-)，女，河北景縣人，衡水市哈勵遜國際和平醫院主管藥師，理學學士，從事臨床藥理學研究。

*通訊作者。E-mail：peng2307@126.com

R593.22

B

1007-3205(2014)06-0706-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.06.031