阿托伐他汀對實驗性腎間質纖維化大鼠細胞間黏附分子1、核因子-κB表達的影響

張麗敏，林海英，劉占全，高 燕，王詠梅，畢朝煜(.河北大學附屬醫院腎內科， 河北 保定 07000；2.河北醫科大學第三醫院腎內科，河北 石家莊 05005)

·論著·

阿托伐他汀對實驗性腎間質纖維化大鼠細胞間黏附分子1、核因子-κB表達的影響

張麗敏1，林海英2*，劉占全1，高 燕1，王詠梅1，畢朝煜1
(1.河北大學附屬醫院腎內科， 河北 保定 071000；2.河北醫科大學第三醫院腎內科，河北 石家莊 050051)

目的研究阿托伐他汀對腎間質纖維化大鼠的腎臟保護機制。方法54只Wistar大鼠隨機分為假手術組(A組，n=18)、單側輸尿管結扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型組(B組，n=18)、阿托伐他汀治療組(C組，n=18)。C組于術前3天開始灌胃(阿托伐他汀10mg·kg-1·d-1，制成混懸液)，A組及B組給予等量生理鹽水灌胃，分別于術后第3、7、14天處死。光鏡觀察腎臟病理改變，并采用免疫組織化學染色測定腎小管間質中細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的表達。結果B組ICAM-1、NF-кB的表達隨梗阻時間延長明顯增加， C組術后第3、7、14天ICAM-1、NF-кB的表達均顯著低于同期B組(P<0.05)。相關分析結果顯示，第3、7、14天NF-кB的表達與同期、同組ICAM-1的表達呈正相關(P<0.05)。結論阿托伐他汀能下調腎小管間質中ICAM-1、NF-кB的表達，抑制和延緩腎間質纖維化的進展。阿托伐他汀對ICAM-1的下調作用至少部分是通過抑制NF-кB的表達而實現的。

腎病；阿托伐他汀；胞間黏附分子1；NK-κB

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.004

腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期的直接原因，腎小管間質損害的嚴重程度與腎臟疾病的預后密切相關。細胞間黏附分子1(intercellularadhesionmolecule1，ICAM-1)是黏附分子家族中的重要成員,可在腎間質迅速增加，與腎小管間質炎細胞浸潤及病變程度密切相關。核因子-кB(nuclearfactor-кB,NF-кB)是普遍存在于細胞質中以p50/p65異二聚體為存在形式的一種快反應轉錄因子，主要參與免疫炎癥反應和某些細胞(如T細胞、系膜細胞等)的生長及抗凋亡作用[1]。ICAM-1的表達受NF-кB的調控，NF-кB的活化可上調其表達。因此，從NF-кB這一環節抑制ICAM-1的作用，可能是一種有效防治腎間質纖維化的方法。近年發現，他汀類藥物除調脂作用外，還具有非依賴降脂的腎保護作用。他汀類藥物可抑制NF-кB的活性。本實驗通過單側輸尿管結扎(unilateralureteralobstruction,UUO)建立腎間質纖維化動物模型，并進行藥物干預，通過免疫組織化學、病理組織學檢查等方法檢查ICAM-1、NF-кB等在腎小管間質的表達情況及用藥后的變化，旨在進一步探討他汀類藥物的腎保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物來源及分組：清潔級健康雄性Wistar大鼠54只(購自河北省實驗動物中心)，隨機分為假手術組(A組)、模型組(B組)、阿托伐他汀治療組(C組)，每組各18只。每組在術后第3、7、14天分批處死，每時點各6只。B、C組行左側輸尿管結扎并剪斷，A組只游離輸尿管，不結扎。于術前3d開始灌胃。C組給予阿托伐他汀(立普妥10mg·kg-1·d-1，溶于生理鹽水，制成混懸液)，A、B組給予等量生理鹽水灌胃。分別于術后第3、7、14天斷頭處死。留取血標本2mL，檢測血清總膽固醇(totalcholesterol,TC)，并留取腎臟標本置于10%中性甲醛中固定，制備石蠟切片，用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson染色及免疫組織化學染色。

1.2 藥品試劑：阿托伐他汀鈣片(商品名立普妥)輝瑞制藥有限公司分裝。兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體，兔抗大鼠NF-кB多克隆抗體，免疫組織化學試劑盒，均購自北京中山生物技術有限公司。

1.3 腎臟組織病理：HE染色、Masson染色后，光鏡下觀察腎小管間質病變程度，Masson染色綠色為膠原纖維，在高倍鏡(×200)下隨即選擇15個不含腎小球及血管的腎皮質視野，以腎間質面積占一個視野場面積的百分比作為相對間質容積值。

1.4 免疫組織化學檢測：石蠟切片常規脫蠟至水(同HE染色)，3%H2O2消除內源性過氧化物酶活性。用1%小牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)封閉，室溫孵育10～15min(封閉組織內電荷)。滴加1/50稀釋的一抗，4℃過夜。滴加生物素標記的二抗，37℃孵育60min。滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物連接法(streptavidin-perosidase,SP)復合物，37℃孵育30～40min。磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline,PBS)4mL、二氨基聯苯胺(3-3-diaminobenzidine,DAB)5g、H2O25μL，顯色5min左右(以鏡下適度為好)。蘇木精復染1min，1%鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片。采用1%BSA代替一抗的組織切片作為陰性對照，已知陽性標本作為陽性對照。光鏡下陽性反應部位為棕黃色。應用真彩色醫學圖像分析系統通過光學顯微鏡攝入圖像，放大200倍，每例切片隨機選取15個不含腎小球和小血管的腎皮質視野，測定陽性著色部位的總積分光密度值，并取其平均值為腎小管間質ICAM-1、NF-кB的陽性面積與著色強度綜合評價指標。

2 結 果

2.1 血清TC的測定：A、B、C3組TC在3、7、14d相同時點差異均無統計學意義(P>0.05)；A、B、C3組TC在3、7、14d不同時點之間差異也無統計學意義(P>0.05)。見表1。

GroupsTC3d7d14dFPA2．15±0．412．04±0．282．22±0．460．3240．729B2．24±0．402．17±0．542．13±0．300．1030．903C2．36±0．272．08±0．432．27±0．570．6310．546F0．0020．1440．145P0．9980．8670．867

TC：total cholesterol

2.2 腎臟病理改變：大體觀察，A組腎臟組織紅潤，無腫大，B、C組梗阻側腎臟體積明顯增大，顏色變白。縱向剖開后，可見腎內積水，積液清亮透明，腎盂腎盞高度擴張，腎皮質明顯萎縮變薄。HE染色A組未見異常。B組第3天可見腎小管輕微擴張，上皮細胞空泡變性，腎間質開始增寬，間質中少量單核細胞與淋巴細胞浸潤。B組第7天可見腎小管擴張，部分小管萎縮、閉塞或壞死，腎間質面積增寬，間質中單核細胞與淋巴細胞浸潤明顯。B組第14天腎小管擴張、壞死明顯，小管基底膜不同程度斷裂，間質中大量單核細胞與淋巴細胞浸潤。Masson染色可見A組大鼠腎臟膠原染色主要位于腎小球基底膜、Bowman囊、系膜區和腎小管間的毛細血管周圍，而小管周圍間質部分比較狹窄。A組在第3、7、14天腎間質纖維化半定量指標無明顯變化(P>0.05),B組在第3、7、14天腎間質纖維化纖維化半定量指標均較A組有明顯升高(P<0.01)，并且隨時間延長，逐漸升高(P<0.01)；C組雖然也有隨時間延長逐漸增高趨勢，但是已經較B組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

GroupsRenalinterstitialvolume3d7d14dFPA0．039±0．0060．040±0．0050．037±0．0020．6460．538B0．103±0．018?0．250±0．025?△0．361±0．035?△☆138．6760．000C0．061±0．006?#0．156±0．023?#△0．211±0．024?#△☆90．8410．000F48．061168．936262．192P0．0000．0000．000

*P<0.01vsA group #P<0.01vsB group △P<0.01vs3d ☆P<0.01vs7d byqtest

2.3 免疫組織化學染色結果

2.3.1 ICAM-1染色：ICAM-1在A組微量表達于腎小管上皮細胞、 腎血管內皮細胞和腎小球系膜細胞(圖1)。A組在第3、7、14天ICAM-1表達無明顯變化(P>0.05),B組在第3、7、14天ICAM-1表達均較A組有明顯升高(P<0.01)，并且隨時間延長，ICAM-1表達逐漸升高(P<0.01)；C組ICAM-1表達雖然也有隨時間延長逐漸增高趨勢，但是已經較B組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

GroupsICAM?13d7d14dFPA93．56±17．5591．35±16．2892．02±17．460．0260．974B358．17±38．93?956．83±56．59?△2199．20±403．20?△☆94．8890．000C182．09±20．52?#716．10±46．93?#△1602．02±89．01?#△☆877．9090．000F146．203633．514124．304P0．0000．0000．000

*P<0.01vsA group #P<0.01vsB group △P<0.01vs3d ☆P<0.01vs7d byqtest
ICAM-1：intercellular adhesion molecule 1

2.3.2 NF-кB染色：NF-кB在A組各時間點僅見少部分的腎小管上皮細胞和腎間質細胞胞漿呈微弱表達(圖2)。A組在第3、7、14天NF-кB表達無明顯變化(P>0.05),B組在第3、7、14天NF-кB表達均較A組有明顯升高(P<0.01)，并且隨時間延長，NF-кB表達逐漸升高(P<0.01)；C組NF-кB表達雖然也有隨時間延長逐漸增高趨勢，但已經較B組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

GroupsNF?кB3d7d14dFPA91．73±14．5495．04±15．7694．25±14．680．0800．924B355．62±44．27?976．52±106．61?△2115．94±423．01?△☆74．6250．000C184．56±27．14?#779．16±38．89?#△1623．10±181．24?△☆267．9880．000F110．925293．44794．351P0．0000．0000．000

*P<0.01vsA group #P<0.01vsB group △P<0.01vs3d ☆P<0.01vs7d byqtest
NF-кB：nuclear factor-кB

2.4 相關性分析：NF-кB與ICAM-1顯著正相關(P<0.05)。見表5。

表5 NF-кB與ICAM-1的表達相關性Table 5 The correlationship of NF-кB and ICAM-1 (r)

*P<0.05
ICAM-1：intercellular adhesion molecule 1；NF-кB：nuclear factor-кB

3 討 論

腎間質纖維化是各種原因引起的腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同病理特征。研究[2]表明，腎間質纖維化的程度與腎功能的相關性比腎小球硬化與腎功能的相關性更為密切，是判斷慢性腎臟病預后的最重要指標之一。腎間質炎細胞尤其是巨噬細胞的急性浸潤是腎小管間質炎癥病變及早期損傷的主要原因，后者又是導致隨后腎間質纖維化形成過程的病理基礎，而黏附分子介導的細胞黏附機制是炎細胞浸潤及小管間質損傷的分子基礎。ICAM-1作為一種主要的黏附分子在腎間質纖維化的病理發展過程中起到了重要作用，它的過度表達導致炎性細胞在腎組織的大量聚積，引起細胞外基質沉積，腎小球和腎小管-間質纖維化[3]。Kriegsman等[4]在大鼠UUO模型中發現ICAM-1/淋巴細胞功能相關抗原的表達與腎間質纖維化的進展呈正相關。Arrizabalaga等[5]也提出，ICAM-1在腎小管間質的表達可作為IgA腎病小管間質損傷的標志。NF-кB是1986年首先由Sen和Baltimore從B淋巴細胞核提取物中發現的一種能與免疫球蛋白к輕鏈基因的增強子B序列特異性結合，并能調節其轉錄活性的蛋白質因子[6]。NF-кB作為具有多向性調節作用的核轉錄因子，參與了多種炎性反應性細胞因子、趨化因子和促纖維因子的合成，以及細胞增殖、細胞外基質交聯及成纖維細胞的分化過程。包括白細胞介素1、白細胞介素2、白細胞介素6、白細胞介素8、單核細胞趨化蛋白、干擾素、血管細胞黏附分子、ICAM-1、P-選擇素等[7]。活化的NF-кB在腎臟疾病的發生發展過程中的作用主要有以下3個方面：①參與腎組織產生化學趨化因子和細胞黏附因子，致單核巨噬細胞浸潤，引起組織炎癥纖維化；②促進成纖維細胞增殖、分化；③與成纖維細胞及腎固有細胞產生前纖維化因子(如轉化生長因子β等)有關。本實驗制備大鼠UUO模型，觀察ICAM-1、NF-кB的表達情況，結果顯示，隨梗阻時間延長，模型組ICAM-1、NF-кB表達逐漸增強，表明ICAM-1、NF-кB在腎間質纖維化的發生、發展中起著重要的作用，是導致腎間質纖維化的重要因素；且NF-кB與ICAM-1的表達呈正相關，提示了NF-кB對ICAM-1的調節作用。

他汀類藥物能有效降低膽固醇的合成而廣泛應用于高膽固醇血癥的治療，可降低心血管事件的發病率和病死率。他汀類藥物除調脂作用外，還具有非依賴降脂的直接腎保護作用。目前發現他汀類藥物非依賴降脂的腎保護作用機制主要包括以下幾個方面：①抗細胞增殖作用。他汀類藥物能夠影響細胞的增殖與死亡之間的平衡，阻止細胞的增殖，促進凋亡，從而減輕腎損傷。有體外研究[8]顯示，他汀類藥物能通過增加細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDK)抑制劑P27Kipl、P21蛋白表達，降低CDK4和CDK2激酶活性，調節細胞周期，抑制系膜細胞增殖，并誘導其凋亡。②減少細胞外基質。他汀類藥物可減少細胞外基質合成，促進其降解，減輕腎臟疾病腎組織中細胞外基質的堆積[9]。③抗炎癥作用。Diomede等[10]在急性炎癥動物模型(Air-Pouch小鼠)研究中發現，經短期的洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀治療后，沒有影響血清TC水平，但可通過下調單核細胞趨化蛋白1、白細胞介素6的表達抑制了急性炎癥白細胞的補充和遷移。

本實驗應用阿托伐他汀對大鼠UUO模型進行干預后，發現治療組ICAM-1、NF-кB表達明顯減弱，說明在UUO狀態下，阿托伐他汀能明顯減輕大鼠腎間質炎癥反應，有效減輕腎間質纖維化程度，其腎保護作用與降低ICAM-1、NF-кB的表達有關。阿托伐他汀對ICAM-1的抑制作用，至少部分是通過下調NF-кB的表達實現的，可能也包括直接的抑制作用，其具體機制尚待進一步研究。且實驗表明血脂水平沒有受到影響，說明阿托伐他汀這一作用是獨立于降脂之外的。(本文圖見封二)

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(本文編輯：許卓文)

EFFECTSOFARTORVASTATINONINTERCELLULARADHESIONMOLECULE-1ANDNUCLEARFACTOR-кBINRATSWITHRENALINTERSTITIALFIBROSIS

ZHANGLimin1,LINHaiying2*,LIUZhanquan1,GAOYan1,WANGYongmei1,BIZhaoyu1
(1.DepartmentofNephrology,theAffiliatedHospitalofHebeiUniversity,HebeiProvince,Baoding071000,China；2.DepartmentofNephrology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveToobservetheprotectiveroleofartorvastatinforkidneyinratswithrenalinterstitialfibrosis.MethodsFifty-fourmaleWistarratswererandomlydividedintothreegroupssham-operatedgroup(groupA,n=18),unilateralureteralobstruction(UUO)group(groupB,n=18),UUOwithartorvastatintreatedgroup(groupC,n=18).Artorvastatinputtouse3daysbeforesurgery.UUOandshamrats

equalvolumephysiologicalsalifbydailygastricgavage.Ratswerekilledafter3,7,14daysofthesurgery.Thekidneypathologicalchangeswereobservedundermicroscope.Theexpressionsofintercellularadhesionmolecule-1 (ICAM-1)andnuclearfactor-кB(NF-кB)wereanalyzedbyroutineimmunohistochemicalmethod.ResultsThelevelsofICAM-1andNF-кBingroupBwerevariousandsignificantlyhigherwiththeextensionofobstructiontime.ThelevelsofICAM-1andNF-кBingroupCweresignificantlylowerthanthoseofgroupBatthesameperiod(P<0.05).ThelevelofNF-кBwassignificantlyassociatedwithICAM-1 (P<0.05).ConclusionArtorvastatinreducesICAM-1andNF-кBexpression,resultingindecreasedtubulardamageandinterstitialfibrosis.TheeffectofartorvastatininreducingICAM-1perhapsimplementsthroughtheinhibitionofNF-кBpartly.

nephrosis；artorvastatin；intercellularadhesionmolecule-1；NF-kappaB

2013-11-18；

2014-02-12

張麗敏(1978-)，女， 河北唐縣人，河北大學附屬醫院主治醫師，醫學碩士，從事腎內科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail: linhaiying@medmail.com.cn

R256.59

A

1007-3205(2014)08-0877-05