不同劑量致敏原對小鼠過敏性哮喘模型特異性抗體和炎性細胞因子的影響

胡德建，張香梅

(山東省濰坊市人民醫院 藥學部，山東 濰坊，261041)

過敏性哮喘是由免疫球蛋白E(IgE)介導的、由肥大細胞、嗜酸性粒細胞及T淋巴細胞等參與的變態反應性疾病。研究[1-2]表明，過敏性哮喘發作時，患者IgE水平顯著升高。有學者報道，不同劑量的過敏原會引發機體輔助性T細胞(Th)向Th1和Th2分化的不同趨勢，從而影響其臨床結局[3-4]。本研究觀察不同劑量的致敏原對過敏性哮喘模型小鼠血清特異性抗體IgE、IgG2a和白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-12(IL-12)、γ-干擾素(IFN-γ)等炎性細胞因子的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組

雌性BALB小鼠45只，8周齡，體質量20～25 g，平均(22.36±1.08) g，均購自山東省實驗動物中心。45只小鼠隨機分為4組：空白對照組10只，低劑量組12只，中劑量組11只，高劑量組12只。

1.2 主要儀器與試劑

超聲霧化器購自上海四菱醫療器械廠，雞卵蛋白(OVA)購自美國Sigma公司，胎牛血清(FBS)及PBS緩沖液均購自武漢博士德生物工程有限公司，ELISA試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 造模方法

分別將10、100、1000 μg的OVA溶于含40 mg氫氧化鋁、pH值7.4的200 μL PBS緩沖液中，各組于第0、7、14天分別進行腹腔注射：空白對照組注射不含OVA的PBS緩沖液200 μL，其余3組分別注射上述含不同劑量OVA的PBS緩沖液200 μL。第15～20天內將小鼠置于霧化吸入箱內進行霧化激發致敏，通過超聲霧化發生器霧化吸入5%的OVA生理鹽水溶液，20 min/(次·d)，共處理6 d。小鼠出現呼吸急促、口唇紫疳、煩躁不安、行動遲緩、腹肌痙攣及大小便失禁等癥狀即為造模成功[5]。

1.4 檢測方法

1.4.1 IgE、IgG2a含量檢測：最后一次霧化激發致敏24 h后，取各組小鼠眼內眥靜脈血，離心后取血清，以ELISA試劑盒檢測特異性抗體IgE、IgG2a含量。

1.4.2 細胞因子檢測：取血后處死小鼠，取出脾臟，在金屬網上磨碎，離心后取細胞沉淀，懸于加有10%FBS的RPMI培養液(100 a U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)中制備單細胞懸液。將細胞懸液置于細胞培養板內，每只小鼠細胞培養2孔，1孔加入200 mg/L的OVA，1孔設為空白對照。細胞培養板置于含5%二氧化碳的潮濕環境中37 ℃培養24 h后，收集上清液置于-80 ℃冰箱保存待測，以ELISA法檢測血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ的含量。

1.4.3 肺組織病理標本制作：小鼠處死后取右肺門至邊緣處3 mm厚度的組織標本，以15%甲醛固定，石蠟包埋切片后，進行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.5 觀察指標

觀察各組小鼠肺組織病理變化、血清特異性抗體IgE、IgG2a水平及血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ水平差異。

2 結 果

2.1 各組肺組織病理變化

空白對照組肺組織無明顯炎細胞浸潤，各給藥組均出現不同程度炎細胞浸潤，低劑量組最為顯著，鏡下可見上皮細胞斷裂或脫落，杯狀細胞增生，血管壁水腫，支氣管壁增厚，周圍見大量以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主的炎細胞浸潤。中、高劑量組炎癥反應依次減輕。見圖1。

圖1 各組肺組織病理圖 (HE染色)

2.2 各組血清特異性抗體水平比較

低、中、高劑量組IgE水平呈遞減趨勢，組間差異顯著(P<0.01)，且均顯著高于對照組(P<0.01); 各實驗組血清IgG2a水平呈遞增趨勢，組間差異顯著(P<0.01)，且均顯著低于對照組(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組血清特異性抗體水平比較±s) pg/mL

2.3 各組血清細胞因子水平比較

低、中、高劑量組血清IL-4、IL-5水平呈遞減趨勢，組間差異顯著(P<0.01)，且均顯著高于對照組(P<0.01)；各實驗組血清IL-12及IFN-γ水平呈遞增趨勢，組間差異顯著(P<0.01)，且均顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ水平比較±s) pg/mL

3 討 論

最早、最經典的過敏性哮喘動物模型是通過豚鼠制備，但由于相應檢測試劑較為缺乏，限制了其廣泛應用，而小鼠試劑來源廣泛，實驗費用相對低廉，近年來逐步地應用于建立哮喘模型[6-7]。

過敏性哮喘是一種以多種炎癥細胞和/或細胞因子浸潤、IgE升高、肺部組織結構重塑以及氣道反應性增高為特征的慢性氣道炎癥，屬于IgE介導的Ⅰ型超敏反應。當致敏原進入機體，CD4+Th2細胞和B細胞被激活，產生特異性IgE[8]，后者與肥大細胞、嗜酸性粒細胞結合，使機體處于致敏狀態；當相同的致敏原再次激發時，肥大細胞等炎性細胞就會釋放大量炎性介質，誘發機體生理功能紊亂，疾病發作。

目前認為，Th1/Th2細胞平衡紊亂，Th1細胞朝向Th2細胞分化，IgE含量增加是過敏性哮喘發作的關鍵環節[9-10]。Th2細胞分泌IL-4、IL-5等多種細胞因子，而IL-4可誘導B細胞的Ig類別轉化，導致IgE增加，IgE既能啟動速發相過敏反應，也可誘發遲發相過敏反應，對過敏性哮喘的發生發展起促進作用; IL-5則具有趨化嗜酸性粒細胞聚集的作用，而嗜酸性粒細胞是參與炎癥浸潤的主要效應細胞，可加速氣道組織結構的破壞，這些炎癥細胞和促炎性細胞因子共同引發或促進呼吸道炎癥的發生和發展。Th2細胞則可分泌IL-12、IFN-γ等細胞因子，抑制Th2型細胞因子的促炎作用，抑制致敏原引發的過敏作用。成功的免疫治療可有效降低IgE水平，誘導B細胞在合成免疫球蛋白時由IgE向IgG轉化，而IgG作為抗體可捕獲抗原，與之形成抗原-抗體復合物，從而緩解過敏癥狀[11]。當小鼠在致敏原作用下出現Th2細胞占優勢，IgE含量增加，而Th1型細胞因子含量降低的趨勢時，就會表現出過敏性哮喘表型，即造模成功。

盡管個體暴露于致敏原下是過敏性哮喘發作的始動環節，但研究發現對過敏性患者重復給予大濃度致敏原的免疫治療可能誘導其產生免疫耐受，患者體內Th2型細胞因子表達水平下降，從而實現哮喘逆轉[12]。因此，掌握恰當的致敏原濃度以確保小鼠模型能真實表現出過敏性哮喘的臨床特征，又不致產生免疫耐受是建立哮喘模型的關鍵問題。商艷等[4]采用不同劑量的OVA致敏激發小鼠，制備過敏性哮喘模型，結果表明，低劑量組(10 μg OVA)小鼠肺部炎癥表現最明顯，支氣管肺泡灌洗液中白細胞、嗜酸性粒細胞含量及血清IgE水平顯著高于對照組及其他各劑量組。湛孝東等[13]采用7種不同濃度的致敏原制備小鼠模型，結果表明，低濃度OVA連續致敏的小鼠肺部病理改變最為顯著，高濃度OVA造模的效果較差。

本研究結果表明，低劑量組小鼠的肺組織炎細胞浸潤最明顯，且血清IgE、IL-4、IL-5水平顯著高于對照組及中、高濃度組，提示10 μg可能是OVA激發致敏制備過敏性哮喘小鼠模型的合適劑量；隨著OVA濃度增加，小鼠血清IgE、IL-4、IL-5水平逐步下降，而血清IgG2a、IL-12及IFN-γ水平逐步增加，提示高濃度的OVA可導致小鼠出現致敏原免疫耐受，造模效果下降，與上述報道基本一致。

[1] Busse W W，Morgan W J，Gergen P J，et al. Randomized trial of omalizumab (anti-IgE) for asthma in inner-city children[J]. New England Journal of Medicine，2011，364(11): 1005.

[2] Jin C，Shelburne C P，Li G，et al. Particulate allergens potentiate allergic asthma in mice through sustained IgE-mediated mast cell activation[J]. The Journal of clinical investigation，2011，121(3): 941.

[3] Huang X，Tang L，Wang F，et al. Astragaloside IV attenuates allergic inflammation by regulation Th1/Th2 cytokine and enhancement CD4+CD25+Foxp3 T cells in ovalbumin-induced asthma[J]. Immunobiology，2014，219(7): 565.

[4] 商艷，李強，黃怡，等. 不同劑量致敏原對小鼠過敏性哮喘模型的影響[J]. 第二軍醫大學學報，2002，23(1): 69.

[5] 樊衛文，楊志軍，孫濱，等. 過敏性哮喘大鼠大腦和肺組織 c-fos 蛋白的表達[J]. 中華結核和呼吸雜志，2001，24(8): 469.

[6] Arnold I C，Dehzad N，Reuter S，et al. Helicobacter pylori infection prevents allergic asthma in mouse models through the induction of regulatory T cells[J]. The Journal of clinical investigation，2011，121(8): 3088.

[7] Ather J L，Ckless K，Martin R，et al. Serum amyloid A activates the NLRP3 inflammasome and promotes Th17 allergic asthma in mice[J]. The Journal of Immunology，2011，187(1): 64.

[8] 吳靜，胡東，李朝品，等. 細菌內毒素對粉塵螨誘導的哮喘小鼠肺部炎癥的免疫調節[J]. 中華微生物學和免疫學雜志，2007，27(12): 1132.

[9] Abrahamsson T R，Sandberg Abelius M，Forsberg A，et al. A Th1/Th2 associated chemokine imbalance during infancy in children developing eczema，wheeze and sensitization[J]. Clinical & Experimental Allergy，2011，41(12): 1729.

[10] Zhao Y，Yang J，Gao Y D. Altered expressions of helper T cell (Th) 1，Th2，and Th17 cytokines in CD8+and γδ T cells in patients with allergic asthma[J]. Journal of Asthma，2011，48(5): 429.

[11] 李雅莉，孫秀珍，張潔，等. 霜天蛾過敏性哮喘患者特異性免疫治療的效果評價[J]. 西安交通大學學報: 醫學版，2003，24(3): 237.

[12] Tarzi M，Klunker S，Texier C，et al. Induction of interleukin 10 and suppressor of cytokine signalling 3 gene expression following peptide immunotherapy[J]. Clinical & Experimental Allergy，2006，36(4): 465.

[13] 湛孝東，姜玉新，李良懌，等. 不同濃度卵蛋白變應原對小鼠哮喘模型建立的影響[J]. 中國實驗動物學報，2012，20(4): 16.