益氣除痰方下調vimentin表達與逆轉 EMT相關性研究※

● 周京旭 林麗珠▲ 王淑美

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益氣除痰方下調vimentin表達與逆轉EMT相關性研究※

● 周京旭1林麗珠1▲王淑美2

目的：觀察益氣除痰方肺癌腫瘤生長、肺轉移的影響，并通過差異蛋白組學技術篩選出差異表達蛋白vimentin，并結合相關技術分析其可能的意義。方法：C57BL小鼠40只，接種Lewis肺癌細胞，造模第2天，隨機分為對照組(生理鹽水)和低、中、高劑量觀察組予益氣除痰方1.0g·kg-1·d-1，3.0g·kg-1·d-1，9.0g·kg-1·d-1，每組10只，灌胃21d后，檢測腫瘤體積、重量、肺轉移灶，分別提取最佳劑量治療組和模型組腫瘤組織的總蛋白，應用雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)系統獲得蛋白點表達差異信息，運用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-TOF)鑒定出差異蛋白質。并以熒光定量PCR和Western blot法對差異蛋白進行表達差異鑒定。培養A549細胞，20%益氣除痰方含藥血清干預，劃痕實驗分析細胞侵襲、轉移能力的改變，RT-PCR檢測其對A549肺癌細胞MMP-1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA基因表達的影響。結果：益氣除痰方3.0g·kg-1·d-1治療組腫瘤體積、瘤重、肺轉移灶數均明顯小于LEWIS模型組(P<0.01)，腫瘤抑制率為57.21%。蛋白質組學研究鑒定受益氣除痰方調控影響的蛋白37個，其中vimentin下調尤其明顯。20%益氣除痰方含藥血清可抑制A549細胞的侵襲和轉移能力，并能降低MMP2、MMP14mRNA基因的表達，與空白組比較差異有顯著性(P<0.01)。結論：益氣除痰方明顯下調vimentin表達，抑制A549細胞的運動能力，減少基質金屬蛋白酶MMP2、MMP14的分泌，這可能與益氣除痰方逆轉肺癌細胞上皮-間質轉化有關，值得進一步研究。

益氣除痰方 LEWIS肺癌 上皮-間質轉化

上皮間質細胞轉化是具有極性的上皮細胞轉換成為具有移行能力的間質細胞并獲得侵襲和遷移能力的過程，上皮細胞標志——E-鈣黏素和細胞角蛋白的表達受到抑制，而誘導表達一種間葉細胞骨架中間纖維組成成分波形蛋白(vimentin)，同時獲得分泌基質金屬蛋白酶的能力[1,2]。益氣除痰方由黨參、生法夏、守宮、露蜂房等組成，通過健脾益氣、化痰散結達到固本抑瘤、兼治標本的功效。臨床研究證明，益氣除痰方能夠明顯延長非小細胞肺癌肺癌患者的生存期，提高生存質量。其療效既和抑制肺癌的生長有關，也和降低肺癌的轉移有關，使患者能較長期的“帶瘤生存”，達到治療目的[3,4]。

本實驗采用比較蛋白質組學的方法，鑒定分析發現益氣除痰方明顯降低LEWIS肺癌細胞vimentin的表達，并進一步分析了調節vimentin表達的意義。

1 材料與方法

1.1材料益氣除痰方(Yiqi Chutan Tang，YQCT)按組成嚴格稱取鑒定。經煮液，過濾，濃縮至含生藥量2g/ml，密閉4℃保存備用。Cy Dye熒光染料(Cy 2，Cy 3，Cy 5)、CHAPS、兩性電解質(pH 3～10 NL)、DTT、24cm IPG 膠條(pH 3～10 NL)、碘乙酰胺(IAA)、Clean-up試劑盒、2D Quant試劑盒等均購自AmershamBioscience公司。IPG-phorⅡ等電聚焦儀、DALT Six電泳系統、Typhoon9400系列多功能激光掃描成像系統、DeCyder差異分析軟件和MALDI-TOF-TOF質譜均為Amersham Bio science公司產品。

1.2方法

1.2.1 造模與給藥 SPF級C57BL小鼠40只，18～20g，雌雄各半。C57BL小鼠d1右腋皮下接種1×107個Lewis肺癌細胞。接種d2開始用藥，治療組予益氣除痰方1.0g·kg-1·d-1，3.0g·kg-1·d-1，9.0g·kg-1·d-1，灌胃，給藥量為0.5mL/只，每天1次，連續灌胃21d；對照組予生理鹽水。接種后每3d稱量一次體重，d 22處死小鼠，檢測各組腫瘤體積、重量、肺轉移灶，取腫瘤組織-80℃保存備用。

1.2.2 雙向電泳[5]用蛋白裂解液提取中劑量實驗組和對照組蛋白，用改良的Bradford法測定提取蛋白樣品的蛋白濃度。熒光標記G1對照組(CY3)，治療組(CY5)，CY2標記內標；G2膠反標記對照組(CY5)，治療組(CY3)，CY2標記內標。將上述三個標記好的樣品混合，進行等點聚焦、SDS-PAGE電泳。凝膠圖像分析，篩選出在兩組中差異表達的蛋白質。

1.2.3 制備質譜樣品及質譜分析 將G1、G2膠進行質譜分析，蛋白質原位酶解，MALDI-TOF-TOF肽質量指紋圖測定，蛋白質鑒定數據庫查詢通過Internet在ExPASY的Peptdent軟件進行搜尋。選擇合適參數，進行匹配。Western blot驗證差異蛋白的表達情況。

1.2.4 劃痕細胞遷移試驗[6]6孔板長滿細胞單

層后，用滅菌10uL槍頭沿細胞中部劃一條直線，洗去細胞碎片，每組設3個復孔，治療組予20%含藥血清，對照組予20%無藥血清，相差顯微鏡觀察劃痕愈合程度，計算遷移率=1-實驗組/對照組×100%。

1.2.5 RT-PCR檢測MMP-1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA的表達[6]A549細胞經20%含藥血清處理24h，Trizol法總RNA，逆轉錄成cDNA，進行PCR擴增。設置PCR擴增條件為：94℃2分鐘；94℃25秒；55℃30秒；72℃30秒；72℃5秒，循環25次。擴增產物1.5%的瓊脂糖電泳后，紫外燈觀察拍照。Quantity one軟件分析定量。見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1益氣除痰方對腫瘤生長的影響無論腫瘤體積、瘤重、肺轉移灶數益氣除痰方治療組均明顯小于對照組組(P<0.01)，其中，中劑量組3.0g·kg-1·d-1腫瘤抑瘤效果最好，最大抑瘤率57.21%。見表2。

表2 益氣除痰方治療21天對小鼠Lewis肺癌實體瘤生長的影響

注：與LEWIS肺癌模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.2 2D-DIGE膠圖分析結果分析以統計學參數：差異參數T-TEST<0.05，差異倍數參數：RITIO<-1.5or>1.5為標準，篩選出治療組與對照差異蛋白點44個，其中治療后上調表達蛋白6個，下調表達蛋白38個。

2.3質譜鑒定結果治療組與對照組44個差異表達蛋白經質譜成功鑒定出37個蛋白，其中波紋蛋白vimentin下調表達最顯著。見表3。

表3 治療組vimentin的差異表達

2.4 Western blot法對部分差異蛋白鑒定結果顯示益氣除痰治療組，vimentin，prolyl 4-hydroxylase，protein disulfide-isomerase A3 precursor，EG433182 protein表達水平較模型組下降，與蛋白質組學實驗結論一致。見圖1。

圖1益氣除痰方對小鼠Lewis肺癌組織表達Vimentin的影響(內參為β-Actin)(Western blot，n=10)

2.5益氣除痰方含藥血清對A549細胞遷移的影響12h后，20%含藥血清組A549細胞遷移率分別為(18.6±2.8)%，對照組為(43.3±2.9)%；24h后，20%含藥血清組細胞的遷移率分別為(43.1±3.3%)，對照組已經長滿。兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.6益氣除痰方含藥血清對A549細胞MMP1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA表達的影響與對照組比較，治療組可明顯降低MMP2、MMP14 mRNA的表達，有顯著性差異(P<0.01)，而MMP1、MMP9mRNA的表達改變不明顯，無顯著性差異(P<0.01)。見圖2。

圖2 益氣除痰方含藥血清對A549細胞MMP1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA的影響

3 討論

肺癌的浸潤轉移，是其治療失敗的主要原因之一。而腫瘤細胞必須獲得侵襲轉移的能力，突破基底膜，必須由上皮形態轉化為間質形態，因而上皮間質細胞轉化是腫瘤發生轉移的關鍵步驟。癌細胞發生上皮間葉細胞轉移時，喪失了上皮細胞極性，E-鈣黏素和細胞角蛋白的表達受到抑制；獲得了成纖維細胞形態，運動侵襲能力、N-鈣黏素和波形蛋白表達，基質金屬蛋白酶和纖連蛋白分泌。EMT通常由腫瘤所處的環境信號激發。也就是說，處于原發灶侵襲性前緣的腫瘤細胞可以從鄰近的反應性基質中獲得特異性信號，從而獲得向間質細胞轉化的能力[1,2]。事實上，多種惡性腫瘤如乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、腸癌等的侵襲轉移過程均觀察到EMT現象，而且腫瘤組織中的發生EMT的腫瘤細胞數目直接與病變組織的侵襲轉移程度相關。腫瘤細胞發生EMT后，侵襲轉移能力明顯增強。用EMT調節因子Twist處理后乳腺癌細胞，Ax1表達上調，侵襲轉移能力明顯增強[7]；過表達EMT相關的轉錄因子Snail/Twist可促進肝癌細胞EMT的發生，肝癌細胞轉移能力增加，而沉默Snail/Twist，使肝癌細胞轉移能力明顯受到抑制[8]。而肺癌發生EMT促進腫瘤的進展、轉移、耐藥，不僅是化療藥物，也包括對分子靶向藥物EGFR TkI的耐藥。肺腺癌細胞株A549經TGF-β1孵育21天以后，轉變為EMT表型的A549-M，其遷徙、轉移能力明顯增強[9]。而用RNAi抑制Snail后，則明顯降低其體外侵襲轉移能力[10]。

益氣除痰方可以明顯抑制腫瘤的生長，減少肺轉移的發生。而上皮間質轉化是腫瘤轉移的首要條件。因而理論上推測益氣除痰方是也抑制A549細胞EMT的發生。可以從以下幾個方面進行探討：(1)腫瘤細胞是否發生了形態學的變化，如從梭形細胞變成圓形細胞；(2)細胞運動遷移能力是否發生改變；(3)一些上皮和間葉組織的細胞標志物是否發生改變。

研究表明，腫瘤侵襲前緣的癌細胞選擇性表達Vimentin，細胞也變成一種拉伸的纖維母細胞形態，而內部的癌細胞不表達Vimentin，細胞也維持上皮樣形態[1]。本研究發現益氣除痰方可明顯抑制Vimentin表達，可能使細胞保持上皮樣形態，也可能與抑制腫瘤上皮向間葉細胞轉化有關。

其次，細胞遷移運動能力的下降，基質金屬蛋白酶的分泌減少也是抑制EMT的表現之一。用益氣除痰方含藥血清處理人肺癌A549細胞株，劃痕實驗發現能明顯抑制細胞的遷移；同時RT-PCR也發現益氣除痰方含藥血清降低MMP-2、MMP-14mRNA基因的表達。而基質金屬蛋白酶是細胞突破基底膜，在細胞外基質中運動最重要的效應分子[11]。

一些上皮和間葉組織的細胞標志物比如E-cad和N-cad是否發生改變尚待檢測，但益氣除痰方逆轉EMT抑制肺癌轉移、耐藥現象，將成為今后工作新的重點領域。

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國家自然科學基金資助項目(No.30772862 )

林麗珠，女，主任醫師，教授，博士研究生導師。E-mail：lizhulin903@21cn.com。

1.廣州中醫藥大學第一臨床學院腫瘤科(510405)；2.重慶醫科大學中醫藥學院(401331)

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