兩個漢族少汗型外胚層發育不良家系患者EDA基因突變檢測*

趙玉苗，孫文聰，張景亮，王麗雯，劉 華，程曉麗#

1)鄭州大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學臨床醫學系 鄭州 450052 3)鄭州華信學院護理系基礎教研室 鄭州 451150 4)鄭州大學第三附屬醫院生殖醫學中心 450052

兩個漢族少汗型外胚層發育不良家系患者EDA基因突變檢測*

趙玉苗1，2)，孫文聰1，2)，張景亮1，3)，王麗雯1，4)，劉 華1)，程曉麗1)#

1)鄭州大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學臨床醫學系 鄭州 450052 3)鄭州華信學院護理系基礎教研室 鄭州 451150 4)鄭州大學第三附屬醫院生殖醫學中心 450052

#通訊作者，女，1963年4月生，副教授，研究方向：遺傳病的分子機制與診斷，E-mail：chengxiaoli@zzu.edu.cn

少汗型外胚層發育不良；EDA基因；突變

目的：檢測兩個漢族少汗型外胚層發育不良家系患者少汗型外胚層發育不良基因(EDA)1、3、5、8、9外顯子的突變情況。方法從兩個家系共16名成員中抽取7名成員，A家系4名、B家系3名。提取7人外周血全基因組的DNA，采用聚合酶鏈反應擴增目的基因后直接進行DNA序列測定，使用BLAST軟件對測序結果進行比對分析，檢測突變。結果3、5、8外顯子上存在G740A、G904A和A1165G點突變，1、8、9外顯子上出現5種移碼突變；家系A和家系B均有患者發生33delC移碼突變和G904A點突變，且這兩種突變在兩個家系上下代之間傳遞。結論少汗型外胚層發育不良的突變基因有很大異質性。33delC、G904A突變可能與少汗型外胚層發育不良的發生有關，33delC和G904A突變對兩家系再發風險的預測具有一定的臨床意義。

X連鎖隱性遺傳型少汗型外胚層發育不良(hypohidrotic ectodermal dysplasia，HED)又被稱為1型外胚層發育不良或Christ-Siemens-Touraine綜合征，是一種以汗腺、毛發、牙齒等外胚層組織發育不全或形態缺陷及免疫力低下為主要特征的罕見先天性遺傳病，符合在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM：#305100)中X連鎖HED的典型臨床表現。新生兒發病率約為1:1 000 000[1]，其基因(ectodysplasin A，EDA)定位于Xq12-13.1，有9個外顯子，編碼391個氨基酸。已公布的與發病相關的各種EDA基因突變種類逾100種[2]。EDA基因存在較大的異質性和種族差異[3]。據Canueto等[2-5]報道，95%的突變都發生在1、3、5、8、9外顯子。該研究中作者檢測了兩個漢族HED家系患者及親屬EDA基因在1、3、5、8、9外顯子的突變類型，以期豐富EDA基因分子數據庫，為開展HED胎兒產前診斷及新生兒病早期臨床分子診斷等服務。

1 對象與方法

1.1研究對象HED家系A和家系B均為漢族，來自河北邯鄲相鄰的農村。兩家系系譜圖見圖1(箭頭標注者為先證者)，患者均為男性。兩先證者(鄭州大學第一附屬醫院皮膚科門診患者)臨床癥狀相似，先天性數顆牙齒缺失、毛發稀少、皮膚干燥，左前臂腹側行毛果蕓香堿發汗試驗未見藍色斑點(發汗試驗陰性)，皮膚組織病理檢測示汗腺密度明顯下降、皮脂腺極少，智力發育正常。其他患者與兩先證者臨床癥狀相似。所有患者符合在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM：#305100)中X連鎖HED的典型臨床表現。經知情同意后，采集到家系A中Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅲ3、Ⅲ4，家系B中Ⅰ2、Ⅱ1和Ⅱ2外周靜脈血各5 mL，EDTA抗凝。采用以往研究中保留的健康個體血樣DNA作對照。

1.2DNA提取經典酚/氯仿法[4]提取DNA，滅菌雙蒸水稀釋，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3PCR擴增引物設計參考文獻[3]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。各外顯子退火溫度、擴增片段長度見表1。PCR總反應體系20 μL：100 ng DNA，10 μL 2×Taq MasterMix，1 μL上、下游引物(500 nmol/L)，8 μL ddH2O。PCR循環參數[3]：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火45 s，72 ℃延伸45 s，共45個循環；最后72 ℃延伸8 min。產物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，電泳時間0.5～1.0 h，電壓100 V，紫外線成像儀檢測結果，照相記錄。

1.4測序與數據分析將擴增產物送北京百泰克生物技術有限公司測序，用Chromas軟件讀取測序結果，Clustal X 軟件進行多重序列比對。應用美國國立生物技術信息中心的BLAST軟件與Gene數據庫公布的人類EDA基因核苷酸序列(Gene ID 1 896)進行比對分析。

圖1 A、B兩HED家系系譜圖

表1 EDA基因各外顯子引物

2 結果

2.1PCR產物電泳結果EDA基因外顯子1、3、5、8、9 PCR擴增產物見圖2。

圖2 外顯子1、3、5、8、9的擴增結果

M：Maker；1：外顯子9；2：外顯子5；3、5：外顯子3；4：外顯子8；6：外顯子1；7：對照。

2.2基因突變檢測結果患者和家系其他成員的外顯子3、5、8上存在G740A、G904A和A1165G點突變；1、8、9外顯子上出現5種移碼突變(表2)。第5外顯子的904位堿基G→A與第9外顯子 1511 位堿基C插入見圖3(箭頭示突變位點)，這兩個位點與Gene數據庫公布的人類EDA基因核苷酸序列(Gene ID 1 896)進行比對分析，結果見圖4、5。33delC和G904A突變在兩個家系上下代之間都存在。

表2 患者和家系其他成員各外顯子突變結果

*:新發突變；ins：插入突變；del：缺失突變。

圖3 外顯子5的904 位堿基G→A突變峰值圖(左)和外顯子的1511位堿基插入峰值圖(右)

圖4 外顯子5 部分核苷酸序列比對結果

Query：患者外顯子5部分序列；Sbjct：NCBI 正常人核苷酸標準序列(Gene ID 1 896)；箭頭示外顯子5的904 位堿基G→A突變。

圖5 外顯子9 部分核苷酸序列比對結果

Query：患者外顯子9部分序列；Sbjct：NCBI 正常人核苷酸標準序列(Gene ID 1 896)；箭頭示外顯子9的1511位插入1個堿基G。

3 討論

EDA基因主要在外胚層中特定的與角質、毛囊、汗腺等起源相關的細胞中表達，其編碼的蛋白含有391個氨基酸，為Ⅱ型三聚體單次跨膜蛋白，具有1個大的細胞外結構域、1個單一跨膜結構域和1個短小的細胞內結構域，其胞外區含膠原結構域(Gly-X-Y)19和腫瘤壞死因子結構域。腫瘤壞死因子結構域片段內的突變將會影響EDA與受體的特異性結合，可導致正常外胚層上皮細胞信號通路中斷，對皮膚及其附屬物的正常發育產生嚴重影響[6-7]。

外顯子5的904位點G→A突變是兩家系患者均存在的突變；該位點位于EDA蛋白胞外區膠原結構域，該突變導致密碼子由GGT變為GAT，可使蛋白多肽鏈第302位甘氨酸變為天冬氨酸。甘氨酸為水溶性氨基酸，天冬氨酸則為酸性。氨基酸性質的轉變可能影響肽鏈胞外區電荷的性質，繼而影響EDA與受體的特異性結合、外胚層上皮細胞信號的傳遞等功能。推測該位點突變可能與外胚層發育有一定關系。

Hashiguchi等[8]對8個不相關的日本EDA家系外顯子1的研究發現存在31delC突變；該突變可引起框移和終止密碼子的提前出現。該研究結果顯示A、B兩家系患者EDA基因外顯子1上均存在33delC突變。1號外顯子33位點位于多肽鏈N端，屬于胞內結構域，是EDA及其受體結合后激活核轉錄因子-κB信號通路的關鍵區域，該通路對細胞信息的轉錄調控起核心作用，在EDA蛋白的二級結構中發揮著關鍵作用。

值得注意的是兩個家系中表型正常的AⅡ2、AⅢ4和BⅠ2也被檢出存在外顯子1 33delC和外顯子5 G904A突變，可以推定患者AⅢ3的33delC和G904A突變來自表型正常的AⅡ2；BⅡ1、BⅡ2的33delC和G904A突變來自表型正常的BⅠ2，即這兩個突變在這兩個家系的上下代之間傳遞，這對臨床預測該病是否再發具有一定的診斷意義，特別是A家系中的Ⅲ1和Ⅲ4婚育時以及B家系中Ⅰ2再生育時有必要進行相關遺傳咨詢與分子水平的基因診斷。此外，A1165G、G740A、520delCTC、1163del GAAGTA、1425insC、1511insG等突變的出現提示誘發HED的突變基因有很大異質性。異質性的存在增添、加大了建立一個適合較大人群的HED分子診斷標準的難度，因此HED的相關分子生物學研究尚需深入進行。

[1]Liu Y，Yu X，Wang L，et al.Mutation p.Leu354Pro in EDA causes severe hypohidrotic ectodermal dysplasia in a Chinese family[J].Gene，2012，491(2)：246

[2]Canueto J，Zafra-Coboa MI，Ciria S，et al.A novel EDA gene mutation in a Spanish family with X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia[J].Actas Dermosifiliogr,2011，102(9)：722

[3]陳建軍，楊森，宋映雪，等.X性連鎖少汗性外胚層發育不良家系ED1基因突變檢測[J].中華皮膚科雜志，2003，36(10)：553

[4]Tong DX，He SP，Wang LW，et al.Association of single- nucleotide polymorphisms in the cannabinoid receptor 2 gene with schizophrenia in the Han Chinese population[J].J Mol Neurosci，2013，51(2)：454

[5]Zhang J，Han D，Song SJ，et al.Correlation between the phenotypes and genotypes of X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia and non-syndromic hypodontia caused by ectodysplasin-A mutations[J].Eur J Med Genet，2011，54(4)：e377

[6]雷科，何祥一.少汗型外胚層發育不良癥相關基因及其蛋白[J].國際口腔醫學雜志，2009，36(1)：120

[7]Fan HL，Ye XQ，Shi L,et al.Mutations in the EDA gene are responsible for X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia and hypodontia in Chinese kindreds[J].Eur J Oral Sci，2008,116(5)：412

[8]Hashiguchi T，Yotsumoto S，Kanzaki T.Mutations in the ED1 gene in Japanese families with X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia[J].Exp Dermatol，2003,12(4)：518

(2013-12-24收稿 責任編輯徐春燕)

Mutation detection of EDA gene in two Han pedigrees with hypohidrotic ectodermal dysplasia

ZHAOYumiao1，2)，SUNWencong1，2)，ZHANGJingliang1，3)，WANGLiwen1，4)，LIUHua1)，CHENGXiaoli1)

1)DepartmentofCellBiologyandMedicalGenetics，CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001 2)DepartmentofClinicalMedicine，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

3)BasicTeachingandResearchingSection,DepartmentofNursing，ZhengzhouHuaxinUniversity，Zhengzhou451150 4)CenterforReproductiveMedicine，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

hypohidrotic ectodermal dysplasia；EDA gene；mutation

Aim：To detect mutations in ectodysplasin A(EDA) gene in two pedigrees with hypohidrotic ectodermal dysplasia(HED).Methods：Seven from 2 pedigrees(16 family members in total) were chosen,among which,4 were from pedigree A,and 3 were from pedigree B.The peripheral blood samples were collected and DNA was extracted.The fragments of exons 1,3,5,8,and 9 were amplified using PCR,the PCR products were sequenced and the results were analyzed by BLAST.Results：There were mutations of G740A,G904A and A1165G in exons 3,5,and 8,and 5 kinds of frameshift mutations in exons 1,8,and 9.33delC and G904A were found in pedigree A and pedigree B,and both mutations could be passed down between generations.Conclusion：33delC and G904A mutations may be associated with HED.33delC and G904A mutations may have some clinical significance in predicting the risk of recurrence of HED.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.05.029

*鄭州大學大學生創新實驗項目資助課題 2009CXSY002

R715.5