人工麝香對卵白蛋白致敏小鼠氣道炎癥損傷的保護作用

袁紹鵬++白金葉+章菽+程桂芳+侯琦

[摘要] 目的 研究人工麝香對卵白蛋白（OVA）致敏引發的小鼠氣道炎癥損傷的保護作用及其機制。 方法 雄性Balb/c小鼠分別于第0天和第14天腹腔注射20 μg OVA和2.25 mg Al（OH）3凝膠致敏，于第28、29、30天從氣管滴入OVA進行攻擊，攻擊前1 h給予受試化合物人工麝香及陽性藥地塞米松。小鼠隨機分為6組：正常對照組（n=11）、模型組（OVA組，n=10）、地塞米松組（Dex組，n=10）、人工麝香給藥10 d組（n=11）、人工麝香給藥7 d組（n=13）、人工麝香給藥5 d組（n=11）。人工麝香皮下給藥100 mg/kg，分別自致敏第21、24、26天開始給藥，給藥周期為10、7、5 d。處死小鼠后，對小鼠的體重、脾臟和胸腺進行稱重，計算脾臟、胸腺指數。檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎癥細胞及炎癥因子IL-4、IL-5及IL-17含量改變，HE染色分析小鼠肺部病理變化，免疫組化分析中性粒細胞生物標志物Ly6G/Gr-1的表達水平。 結果 與模型組相比，人工麝香100 mg/kg連續給藥5、7 d可改善OVA致敏引發的小鼠氣道炎癥，明顯降低小鼠BALF炎癥細胞因子IL-4、IL-5、IL-17的含量（P < 0.05）。細胞分類計數、肺組織病理分析及免疫組化結果表明，人工麝香能夠抑制小鼠肺部氣道中炎癥細胞，特別是中性粒細胞的浸潤，以及中性粒細胞標志物Ly6G/Gr-1的表達。 結論 人工麝香具有較強的減輕OVA致敏引發的小鼠氣道炎癥損傷的功能，提示人工麝香對于哮喘可能有一定的治療作用。

[關鍵詞] 人工麝香；哮喘；氣道炎癥；中性粒細胞；白介素17

[中圖分類號] R285.5[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）06（b）-0004-05

Investigation for the effects of artifitial musk on attenuation of OVA-challenged murine airway inflammation

YUAN Shaopeng1 BAI Jinye1 ZHANG Shu2 CHENG Guifang1 HOU Qi1▲

1.Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China; 2.Beijing Lianxin Pharmaceutic Co., Ltd., Beijing 102600, China

[Abstract] Objective To investigate the effects of artifitial musk on attenuation of OVA-challenged murine airway inflammation in vivo and its mechanism. Methods Male Balb/c mice were divided into 6 groups, including control (n=11), OVA model (n=10), Dex (n=10), artifitial musk 10 days (n=11), artifitial musk 7 days (n=13), and artifitial musk 5 days (n=11). Mice were immunized intraperitoneally with 20 μg ovalbumin (OVA) and 4 mg Al(OH)3 suspended in 0.1 mL saline solution on Day 0 and Day 14, and then intratracheally challenged with 1% OVA suspended in saline solution on Days 28-30. Artifitial musk (100 mg/kg, s.c.) was given 1 hour before each OVA challenge for 5, 7 and 10 days since the sensitization for 21, 24, 26 days, respectively. After sacrificed, the body weights, spleen index and thymus index were calculated. In addition, pathologic changes in the lung tissues, number of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and expression levels of IL-4, IL-5, IL-17 were observed. Moreover, the expression levels of Ly6G/Gr-1, a major biomarker of neutrophil, was detected by immunohistochemical examination. Results Compared with OVA model, the airway inflammation in mice improved after treatment with 100 mg/kg artifitial musk for 5 and 7 days in vivo. Moreover, the expression levels of major cytokines as IL-4, IL-5 and IL-17 in BALF were inhibited after treatment with musk (P < 0.05). Pathological and cell count results showed that the inflammatory cell especially neutrophile granulocyte infiltration in the airway section reduced after treatment with artifitial musk. Furthermore, immunohistochemical examination results showed that the expression levels of Ly6G/Gr-1 were inhibited upon the treatment. Conclusion The results showed that artifitial musk possesses inhibitory effects on airway inflammation induced with OVA in vivo and the therapeutic function on asthma in the future.

[Key words] Artifitial musk; Asthma; Airway inflammation; Neutrophil; IL-17

哮喘是由氣道慢性炎癥引起的肺部疾病，既往認為Ⅰ型輔助性T淋巴細胞（Th1）與Ⅱ型輔助性T淋巴細胞（Th2）在數量、活化及功能方面的失衡是哮喘發病的重要環節，從而引起Th2型淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等失調白介素（IL）-4、IL-5、IL-13等Th2型炎癥因子的過量表達，最終導致氣道炎癥和氣道高反應性（AHR）的發生[1-2]。近年來的研究發現，中性粒細胞在哮喘氣道炎癥發生過程中發揮重要作用[3]。中性粒細胞不僅可以導致急性哮喘的惡化，還大量存在于慢性重癥哮喘患者的氣道中。中性粒細胞具有趨化、吞噬、產生氧自由基及釋放作用等功能。除了重要的防御作用外，中性粒細胞可以引起感染部位的炎癥，使炎性反應進一步加重，引起病理性損害。因此，通過抑制中性粒細胞在氣道炎癥微環境中的過度表達，對治療哮喘，特別是嚴重性哮喘，將可能發揮重要的功能[4]。新近研究表明，炎癥因子IL-17在調控哮喘中性粒細胞浸潤過程中發揮重要的功能，是目前哮喘治療及藥物研發的新型作用靶點[5-6]。麝香是中國傳統醫藥中極其珍貴的藥品之一，對心血管、神經系統、呼吸系統、內分泌及免疫功能均有廣泛的影響[7]。自20世紀70年代，中國醫學科學院藥物研究所科研人員利用現代藥學和生物學理論和技術，在對麝香的化學和藥理學進行了系統深入的研究的基礎上，制備了人工麝香。本課題組既往的研究結果證明，麝香中水溶性多肽蛋白質具有顯著地抑制中性粒細胞的功能[8]，能夠抑制中性粒細胞活性脂質生成、游離Ca2+水平以及細胞內容物的釋放，從而發揮抗炎免疫調節活性。本文研究人工麝香對卵白蛋白（OVA）引發的小鼠氣道炎癥的活性，考察其對相關炎癥細胞因子，如IL-4、IL-5和IL-17等表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Balb/c小鼠，（20±2）g，SPF級，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供[合格證：SCXK-（京） 2009-0007]。

1.2 藥物與試劑

OVA（美國Sigma公司），人工麝香（北京聯馨藥業有限公司），地塞米松（Sigma公司分裝）。IL-4、IL-5和IL-17 ELISA檢測試劑盒購自BioLegend公司。Ly6G/Gr-1抗體購自R&D公司。

1.3 動物分組及模型建立

小鼠隨機分為6組：正常對照組（n=11）、模型組（OVA組，n=10）、地塞米松組（Dex組，n=10）、人工麝香給藥10 d組（n=11）、人工麝香給藥7 d組（n=13）、人工麝香給藥5 d組（n=11）。小鼠分別于第0天和第14天腹腔注射20 μg OVA和2.25 mg Al（OH）3凝膠，第28、29、30天將100 μg OVA溶解在50 μL生理鹽水中，以氣管滴入方式進行攻擊，攻擊前1 h給予人工麝香及陽性藥地塞米松。

1.4 給藥方式和初始劑量

人工麝香，100 mg/kg劑量皮下給藥，分別自致敏第21、24、26天開始給藥，給藥周期為10、7、5 d。陽性藥地塞米松，1 mg/kg，灌胃給藥。

1.5 檢測指標

1.5.1 動物死亡記錄和稱重動物死亡情況隨時記錄，處死小鼠后，對小鼠的體重、脾臟和胸腺進行稱重，計算脾臟、胸腺指數。

1.5.2 支氣管肺泡灌洗液炎癥細胞及炎癥因子檢測小鼠在末次激發后24 h，切開頸部皮膚暴露氣管，插入灌流針，用預冷的PBS 1 mL行肺部灌洗3次，吸出支氣管肺泡灌洗液（BALF）液，4℃離心5 min，細胞沉淀用PBS緩沖液重懸，以全自動血球分析儀進行細胞分類計數。上清用ELISA方法分析BALF中IL-4、IL-5、IL-17含量。

1.5.3 小鼠肺部病理分析取出小鼠完整的左側肺組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后進行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察對比各組小鼠肺組織病理形態學改變。

1.5.4 小鼠肺部免疫組化分析部分小鼠肺組織用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后進行免疫組化檢測，分析其中中性粒細胞生物標志物Ly6G/Gr-1的表達水平。具體步驟為：石蠟切片常規脫蠟至水；3%過氧化氫 （H2O2）孵育10 min，去除內源性過氧化物酶；微波處理；加入二抗同源的正常血清封閉20 min；加入一抗，置于濕盒4℃ 過夜；加二抗室溫孵育2 h；加入鏈霉親和素辣根過氧化物酶復合物20 min；二氨基聯苯胺 （DAB）顯色5 min；雙蒸水沖洗，常規蘇木精復染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。結果判定：細胞核清晰、胞質有黃色或褐色著色的細胞為陽性細胞。

1.6 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物體重、脾臟及胸腺指數的變化

與模型組相比，給予人工麝香5、7、10 d后，小鼠的胸腺指數未見顯著變化，但是小鼠脾臟指數呈現劑量相關性的增加。各組動物體重、脾臟及胸腺指數的變化見表1。

2.2 支氣管肺泡灌洗液中白細胞、淋巴細胞及中性粒細胞計數

如圖1和表2結果所示，與正常對照組相比，模型組小鼠BALF中白細胞、淋巴細胞以及中性粒細胞計數明顯升高（P < 0.05）；與模型組比較，人工麝香100 mg/kg連續給藥5、7 d可明顯抑制小鼠氣道炎癥細胞的增加，以及淋巴細胞、中性粒細胞的升高（P < 0.05）。但是，人工麝香連續給藥10 d后，與模型組相比，未見明顯的治療活性（P > 0.05）。因此，本研究后續重點關注人工麝香連續給藥5 d和7 d的情況。

與正常對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001

圖1 小鼠支氣管肺泡灌洗液中主要炎癥細胞分類計數

表2 小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞、淋巴細胞

及中性粒細胞計數（104/mL，x±s）

注：與正常對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001

2.3 支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子表達量分析

炎癥因子對小鼠氣道炎癥細胞的招募與浸潤發揮重要的調節作用，本研究進一步檢測了氣道灌洗液中Th2炎癥因子IL-4、IL-5及中性粒細胞關鍵調控因子IL-17的含量。如圖2和表3結果所示，與正常對照組相比，模型組小鼠BALF液中炎癥因子IL-4、IL-5和IL-17的含量顯著升高（P < 0.01）；與模型組相比，人工麝香治療有效組，即給藥5 d和給藥7 d后，均明顯抑制小鼠氣道炎癥因子的含量（P < 0.01），其中，人工麝香能明顯抑制IL-17蛋白含量（P < 0.001），且活性高于陽性藥地塞米松。

與正常對照組相比，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001

圖2 小鼠支氣管肺泡灌洗液中主要炎癥因子含量

表3 小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子表達（pg/mL，x±s）

注：與正常對照組相比，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；IL-4：白介素4；IL-5：白介素5；IL-17：白介素17

2.4 小鼠肺組織病理分析

小鼠肺部病理結果表明，與正常對照組相比，模型組小鼠肺間質有大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤。與模型組相比，人工麝香治療有效組，間質散在少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道炎癥細胞的浸潤及侵襲。見圖3。

2.5 免疫組化分析小鼠肺組織Ly6G/Gr-1表達

小鼠肺部免疫組化分析結果表明，與正常對照組相比，模型組小鼠肺部中性粒細胞標志物Ly6G/Gr-1的表達明顯升高；與模型組相比，人工麝香治療有效組，Ly6G/Gr-1的表達被顯著抑制，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道中性粒細胞的招募以及受體蛋白的表達。見圖4。

3 討論

麝香作為一種重要的治療非特異性炎癥的藥物，已經在臨床上取得一定的效果，其抗炎免疫活性已有相關報道。然而盡管有文獻報道人工麝香在臨床中可用于治療哮喘，特別是對頑固性慢性哮喘有效，但對于其相關作用機制的研究未見報道。本研究實驗結果初步證明，人工麝香具有明顯的抗炎及免疫抑制活性，100 mg/kg連續給藥5、7 d可有效抑制小鼠氣道炎癥，降低氣道內炎癥細胞及炎癥因子的含量。有意義的是，人工麝香能夠顯著抑制慢性炎癥因子IL-17的表達以及中性粒細胞的招募和浸潤，這些研究結果部分解釋了人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機制。

近年來，中性粒細胞在哮喘，特別是頑固性哮喘發病及進展過程中的活性日益受到關注[9]。既往認為，Th2型淋巴細胞以及嗜酸性粒細胞的增加是哮喘發病的重要原因。但是，臨床研究結果證明，40%~50%的哮喘患者中Th2型淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等未見顯著變化[10]。尤其是近年來，針對IL-5等嗜酸性粒細胞趨化因子的藥物在臨床治療中未取得預期療效，進一步證明有其他的炎癥細胞參與了哮喘的發生及進展。越來越多的研究證明，中性粒細胞在哮喘的發生過程中，特別是嚴重性哮喘的發病中發揮重要的作用。除了重要的防御作用外，中性粒細胞可以引起感染部位的炎癥，使炎癥反應進一步加重，引起病理性損害[11]。人工麝香中水溶性多肽蛋白質具有顯著的抑制中性粒細胞的功能。既往研究證明，人工麝香能夠抑制中性粒細胞活性脂質生成、游離Ca2+水平以及細胞內溶物的釋放，從而發揮抗炎免疫調節活性。本研究研究結果表明，在OVA致敏的小鼠氣道中，有顯著性的中性粒細胞增加，以及其生物標志物Ly6G/Gr-1含量的升高。這進一步證明人工麝香在體內可能通過抑制中性粒細胞的招募和浸潤，發揮抗炎免疫調節活性。同時，本研究結果也證明，通過抑制中性粒細胞在氣道中的侵襲和浸潤，對治療哮喘氣道炎癥，將可能發揮重要的功能。

IL-17在調控中性粒細胞的趨化過程中發揮重要的功能。IL-17通過調控氣道微環境中的結構細胞及炎癥細胞，促進中性粒細胞趨化及調控因子的表達和分泌，從而促進中性粒細胞的招募、黏附及浸潤[12]。本研究研究結果表明，人工麝香能顯著抑制氣道灌洗液中IL-17的表達含量，其活性甚至強于地塞米松。這一結果提示，人工麝香可能通過抑制IL-17的表達，進而影響了氣道內中性粒細胞的招募、黏附等活性，從而抑制中性粒細胞在氣道內的浸潤，發揮治療哮喘氣道炎癥的活性。由于文獻報道，人工麝香對頑固性哮喘具有顯著的療效，本研究結果將有助于解釋人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機制[6，13]。

本研究也探索了在有效治療劑量下，不同給藥天數對小鼠氣道炎癥的抑制活性。有意思的是，人工麝香的治療活性有一定的時間窗。當給藥10 d后，未觀察到顯著的炎癥細胞抑制活性。由于未進行體內藥代動力學研究，筆者推測當給藥天數增加后，可能會促進體內拮抗因子或細胞的增加，從而抵消甚至促進機體的免疫反應。因此，未來的實驗中，除了檢測體內的藥物代謝時間及藥物分布外，也需要檢測相關抗體等，從而綜合評價及指導人工麝香的用藥及治療。

綜合以上研究，本研究初步實驗結果表明，人工麝香具有顯著的抗炎免疫調節活性，能夠抑制小鼠氣道炎癥，炎癥細胞趨化和浸潤以及炎癥因子的表達。以上結果，對于未來研發哮喘治療藥物，提供了重要的理論及實驗依據。

[參考文獻]

[1]Wenzel SE. Asthma phenotypes：the evolution from clinical to molecular approaches [J]. Nature Medicine，2012，18：716-725.

[2]Zhu J. Transcriptional regulation of Th2 cell differentiation [J]. Immunology and Cell Biology，2010，88：244-249.

[3]Mantovani A，Cassatella MA，Costantini C，et al. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity [J]. Nature Reviews，2011，11：519-531.

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[5]Chang SH，Dong C. Signaling of interleukin-17 family cytokines in immunity and inflammation [J]. Cellular Signaling，2011，23：1069-1075.

[6]Park SJ，Lee YC. Interleukin-17 regulation： an attractive therapeutic approach for asthma [J]. Respiratory Research， 2010，11：78.

[7]程桂芳，劉大培，白金葉，等.麝香的藥理研究Ⅳ.麝香對大鼠炎性滲出液中白細胞花生四烯酸代謝的影響 [J].中國醫學科學院學報，1992，14（5）：346-350.

[8]王文杰，白金葉，程桂芳，等.麝香糖蛋白成分對白三烯B4激活的大鼠中性白細胞功能的影響[J].中國中藥雜志，1998，23（4）：46-48，65.

[9]Nials AT，Uddin S. Mouse models of allergic asthma： acute and chronic allergen challenge [J]. Disease Models & Mechanisms，2008，1：213-220.

[10]Pavord ID. Non-eosinophilic asthma and the innate immune response [J]. Thorax，2007，62：193-194.

[11]Linden A，Laan M，Anderson GP. Neutrophils，interleukin-17A and lung disease [J]. Eur Respir J，2005，25：159-172.

[12]Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al. IL-17 and Th17 Cells [J]. Annual Review of Immunology，2009，27：485-517.

[13]Lajoie S，Lewkowich IP，Suzuki Y，et al. Complement-mediated regulation of the IL-17A axis is a central genetic determinant of the severity of experimental allergic asthma [J]. Nature Immunology，2010，11：928-935.

（收稿日期：2014-03-16本文編輯：程銘）

[基金項目] 教育部高等學校博士學科點專項科研基金（編號2010 1106120023）。

[作者簡介] 袁紹鵬（1977.11-），男，博士；研究方向：免疫抑制劑研究。

圖2 小鼠支氣管肺泡灌洗液中主要炎癥因子含量

表3 小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子表達（pg/mL，x±s）

注：與正常對照組相比，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；IL-4：白介素4；IL-5：白介素5；IL-17：白介素17

2.4 小鼠肺組織病理分析

小鼠肺部病理結果表明，與正常對照組相比，模型組小鼠肺間質有大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤。與模型組相比，人工麝香治療有效組，間質散在少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道炎癥細胞的浸潤及侵襲。見圖3。

2.5 免疫組化分析小鼠肺組織Ly6G/Gr-1表達

小鼠肺部免疫組化分析結果表明，與正常對照組相比，模型組小鼠肺部中性粒細胞標志物Ly6G/Gr-1的表達明顯升高；與模型組相比，人工麝香治療有效組，Ly6G/Gr-1的表達被顯著抑制，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道中性粒細胞的招募以及受體蛋白的表達。見圖4。

3 討論

麝香作為一種重要的治療非特異性炎癥的藥物，已經在臨床上取得一定的效果，其抗炎免疫活性已有相關報道。然而盡管有文獻報道人工麝香在臨床中可用于治療哮喘，特別是對頑固性慢性哮喘有效，但對于其相關作用機制的研究未見報道。本研究實驗結果初步證明，人工麝香具有明顯的抗炎及免疫抑制活性，100 mg/kg連續給藥5、7 d可有效抑制小鼠氣道炎癥，降低氣道內炎癥細胞及炎癥因子的含量。有意義的是，人工麝香能夠顯著抑制慢性炎癥因子IL-17的表達以及中性粒細胞的招募和浸潤，這些研究結果部分解釋了人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機制。

近年來，中性粒細胞在哮喘，特別是頑固性哮喘發病及進展過程中的活性日益受到關注[9]。既往認為，Th2型淋巴細胞以及嗜酸性粒細胞的增加是哮喘發病的重要原因。但是，臨床研究結果證明，40%~50%的哮喘患者中Th2型淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等未見顯著變化[10]。尤其是近年來，針對IL-5等嗜酸性粒細胞趨化因子的藥物在臨床治療中未取得預期療效，進一步證明有其他的炎癥細胞參與了哮喘的發生及進展。越來越多的研究證明，中性粒細胞在哮喘的發生過程中，特別是嚴重性哮喘的發病中發揮重要的作用。除了重要的防御作用外，中性粒細胞可以引起感染部位的炎癥，使炎癥反應進一步加重，引起病理性損害[11]。人工麝香中水溶性多肽蛋白質具有顯著的抑制中性粒細胞的功能。既往研究證明，人工麝香能夠抑制中性粒細胞活性脂質生成、游離Ca2+水平以及細胞內溶物的釋放，從而發揮抗炎免疫調節活性。本研究研究結果表明，在OVA致敏的小鼠氣道中，有顯著性的中性粒細胞增加，以及其生物標志物Ly6G/Gr-1含量的升高。這進一步證明人工麝香在體內可能通過抑制中性粒細胞的招募和浸潤，發揮抗炎免疫調節活性。同時，本研究結果也證明，通過抑制中性粒細胞在氣道中的侵襲和浸潤，對治療哮喘氣道炎癥，將可能發揮重要的功能。

IL-17在調控中性粒細胞的趨化過程中發揮重要的功能。IL-17通過調控氣道微環境中的結構細胞及炎癥細胞，促進中性粒細胞趨化及調控因子的表達和分泌，從而促進中性粒細胞的招募、黏附及浸潤[12]。本研究研究結果表明，人工麝香能顯著抑制氣道灌洗液中IL-17的表達含量，其活性甚至強于地塞米松。這一結果提示，人工麝香可能通過抑制IL-17的表達，進而影響了氣道內中性粒細胞的招募、黏附等活性，從而抑制中性粒細胞在氣道內的浸潤，發揮治療哮喘氣道炎癥的活性。由于文獻報道，人工麝香對頑固性哮喘具有顯著的療效，本研究結果將有助于解釋人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機制[6，13]。

本研究也探索了在有效治療劑量下，不同給藥天數對小鼠氣道炎癥的抑制活性。有意思的是，人工麝香的治療活性有一定的時間窗。當給藥10 d后，未觀察到顯著的炎癥細胞抑制活性。由于未進行體內藥代動力學研究，筆者推測當給藥天數增加后，可能會促進體內拮抗因子或細胞的增加，從而抵消甚至促進機體的免疫反應。因此，未來的實驗中，除了檢測體內的藥物代謝時間及藥物分布外，也需要檢測相關抗體等，從而綜合評價及指導人工麝香的用藥及治療。

綜合以上研究，本研究初步實驗結果表明，人工麝香具有顯著的抗炎免疫調節活性，能夠抑制小鼠氣道炎癥，炎癥細胞趨化和浸潤以及炎癥因子的表達。以上結果，對于未來研發哮喘治療藥物，提供了重要的理論及實驗依據。

[參考文獻]

[1]Wenzel SE. Asthma phenotypes：the evolution from clinical to molecular approaches [J]. Nature Medicine，2012，18：716-725.

[2]Zhu J. Transcriptional regulation of Th2 cell differentiation [J]. Immunology and Cell Biology，2010，88：244-249.

[3]Mantovani A，Cassatella MA，Costantini C，et al. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity [J]. Nature Reviews，2011，11：519-531.

[4]Alcorn JF，Crowe CR，Kolls JK. Th17 cells in asthma and COPD [J]. Annual Review of Physiology，2010，72：495-516.

[5]Chang SH，Dong C. Signaling of interleukin-17 family cytokines in immunity and inflammation [J]. Cellular Signaling，2011，23：1069-1075.

[6]Park SJ，Lee YC. Interleukin-17 regulation： an attractive therapeutic approach for asthma [J]. Respiratory Research， 2010，11：78.

[7]程桂芳，劉大培，白金葉，等.麝香的藥理研究Ⅳ.麝香對大鼠炎性滲出液中白細胞花生四烯酸代謝的影響 [J].中國醫學科學院學報，1992，14（5）：346-350.

[8]王文杰，白金葉，程桂芳，等.麝香糖蛋白成分對白三烯B4激活的大鼠中性白細胞功能的影響[J].中國中藥雜志，1998，23（4）：46-48，65.

[9]Nials AT，Uddin S. Mouse models of allergic asthma： acute and chronic allergen challenge [J]. Disease Models & Mechanisms，2008，1：213-220.

[10]Pavord ID. Non-eosinophilic asthma and the innate immune response [J]. Thorax，2007，62：193-194.

[11]Linden A，Laan M，Anderson GP. Neutrophils，interleukin-17A and lung disease [J]. Eur Respir J，2005，25：159-172.

[12]Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al. IL-17 and Th17 Cells [J]. Annual Review of Immunology，2009，27：485-517.

[13]Lajoie S，Lewkowich IP，Suzuki Y，et al. Complement-mediated regulation of the IL-17A axis is a central genetic determinant of the severity of experimental allergic asthma [J]. Nature Immunology，2010，11：928-935.

（收稿日期：2014-03-16本文編輯：程銘）

[基金項目] 教育部高等學校博士學科點專項科研基金（編號2010 1106120023）。

[作者簡介] 袁紹鵬（1977.11-），男，博士；研究方向：免疫抑制劑研究。

圖2 小鼠支氣管肺泡灌洗液中主要炎癥因子含量

表3 小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子表達（pg/mL，x±s）

注：與正常對照組相比，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；IL-4：白介素4；IL-5：白介素5；IL-17：白介素17

2.4 小鼠肺組織病理分析

小鼠肺部病理結果表明，與正常對照組相比，模型組小鼠肺間質有大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤。與模型組相比，人工麝香治療有效組，間質散在少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道炎癥細胞的浸潤及侵襲。見圖3。

2.5 免疫組化分析小鼠肺組織Ly6G/Gr-1表達

小鼠肺部免疫組化分析結果表明，與正常對照組相比，模型組小鼠肺部中性粒細胞標志物Ly6G/Gr-1的表達明顯升高；與模型組相比，人工麝香治療有效組，Ly6G/Gr-1的表達被顯著抑制，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道中性粒細胞的招募以及受體蛋白的表達。見圖4。

3 討論

麝香作為一種重要的治療非特異性炎癥的藥物，已經在臨床上取得一定的效果，其抗炎免疫活性已有相關報道。然而盡管有文獻報道人工麝香在臨床中可用于治療哮喘，特別是對頑固性慢性哮喘有效，但對于其相關作用機制的研究未見報道。本研究實驗結果初步證明，人工麝香具有明顯的抗炎及免疫抑制活性，100 mg/kg連續給藥5、7 d可有效抑制小鼠氣道炎癥，降低氣道內炎癥細胞及炎癥因子的含量。有意義的是，人工麝香能夠顯著抑制慢性炎癥因子IL-17的表達以及中性粒細胞的招募和浸潤，這些研究結果部分解釋了人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機制。

近年來，中性粒細胞在哮喘，特別是頑固性哮喘發病及進展過程中的活性日益受到關注[9]。既往認為，Th2型淋巴細胞以及嗜酸性粒細胞的增加是哮喘發病的重要原因。但是，臨床研究結果證明，40%~50%的哮喘患者中Th2型淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等未見顯著變化[10]。尤其是近年來，針對IL-5等嗜酸性粒細胞趨化因子的藥物在臨床治療中未取得預期療效，進一步證明有其他的炎癥細胞參與了哮喘的發生及進展。越來越多的研究證明，中性粒細胞在哮喘的發生過程中，特別是嚴重性哮喘的發病中發揮重要的作用。除了重要的防御作用外，中性粒細胞可以引起感染部位的炎癥，使炎癥反應進一步加重，引起病理性損害[11]。人工麝香中水溶性多肽蛋白質具有顯著的抑制中性粒細胞的功能。既往研究證明，人工麝香能夠抑制中性粒細胞活性脂質生成、游離Ca2+水平以及細胞內溶物的釋放，從而發揮抗炎免疫調節活性。本研究研究結果表明，在OVA致敏的小鼠氣道中，有顯著性的中性粒細胞增加，以及其生物標志物Ly6G/Gr-1含量的升高。這進一步證明人工麝香在體內可能通過抑制中性粒細胞的招募和浸潤，發揮抗炎免疫調節活性。同時，本研究結果也證明，通過抑制中性粒細胞在氣道中的侵襲和浸潤，對治療哮喘氣道炎癥，將可能發揮重要的功能。

IL-17在調控中性粒細胞的趨化過程中發揮重要的功能。IL-17通過調控氣道微環境中的結構細胞及炎癥細胞，促進中性粒細胞趨化及調控因子的表達和分泌，從而促進中性粒細胞的招募、黏附及浸潤[12]。本研究研究結果表明，人工麝香能顯著抑制氣道灌洗液中IL-17的表達含量，其活性甚至強于地塞米松。這一結果提示，人工麝香可能通過抑制IL-17的表達，進而影響了氣道內中性粒細胞的招募、黏附等活性，從而抑制中性粒細胞在氣道內的浸潤，發揮治療哮喘氣道炎癥的活性。由于文獻報道，人工麝香對頑固性哮喘具有顯著的療效，本研究結果將有助于解釋人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機制[6，13]。

本研究也探索了在有效治療劑量下，不同給藥天數對小鼠氣道炎癥的抑制活性。有意思的是，人工麝香的治療活性有一定的時間窗。當給藥10 d后，未觀察到顯著的炎癥細胞抑制活性。由于未進行體內藥代動力學研究，筆者推測當給藥天數增加后，可能會促進體內拮抗因子或細胞的增加，從而抵消甚至促進機體的免疫反應。因此，未來的實驗中，除了檢測體內的藥物代謝時間及藥物分布外，也需要檢測相關抗體等，從而綜合評價及指導人工麝香的用藥及治療。

綜合以上研究，本研究初步實驗結果表明，人工麝香具有顯著的抗炎免疫調節活性，能夠抑制小鼠氣道炎癥，炎癥細胞趨化和浸潤以及炎癥因子的表達。以上結果，對于未來研發哮喘治療藥物，提供了重要的理論及實驗依據。

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（收稿日期：2014-03-16本文編輯：程銘）

[基金項目] 教育部高等學校博士學科點專項科研基金（編號2010 1106120023）。

[作者簡介] 袁紹鵬（1977.11-），男，博士；研究方向：免疫抑制劑研究。