Cd(II)對多環(huán)芳烴降解菌Bacillus sp. P1產(chǎn)酶及酶促降解過程影響研究*

曾光明，劉少恒，牛秋雅，劉云國，胡新將

(1.湖南大學 環(huán)境科學與工程學院，湖南 長沙 410082；2.環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室(湖南大學)，湖南 長沙 410082)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的有機污染物，由于具有急慢性毒性作用，甚至可致畸、致癌、致突變[1]，其對環(huán)境的污染和危害已經(jīng)成為一個備受關(guān)注的問題．微生物降解PAHs是一種能夠經(jīng)濟高效地減少PAHs污染的方式[2]．該過程中，微生物分泌的各種胞外和胞內(nèi)酶[3]對PAHs的開環(huán)降解過程起關(guān)鍵作用．而重金屬會通過影響微生物的生理活動從而影響其酶的分泌過程，也會通過氧化[4]或者與巰基(-SH)結(jié)合[5]等方式影響酶的結(jié)構(gòu)或活性，從而影響其酶促降解性能．因此，重金屬對PAHs降解微生物產(chǎn)酶過程及酶促降解過程的影響可能是其影響微生物對PAHs降解能力的機制之一.而近年來，國內(nèi)外學者對于重金屬影響PAHs生物降解的研究主要集中在其對降解效率的影響方面[6]，對于其影響降解效率的機理卻少有深入研究．

菲(Phenanthrene)是一種PAHs污染環(huán)境中常見的污染物，且其兼具灣區(qū)結(jié)構(gòu)和K區(qū)結(jié)構(gòu)，是致癌PAHs的最小結(jié)構(gòu)單元[7]，常被作為研究PAHs生物降解的模式化物質(zhì)．鎘在污染環(huán)境中分布廣泛，對人類及環(huán)境危害較大，是一種典型的重金屬污染物．因此，本實驗分別以菲和Cd(II)作為PAHs和重金屬的代表性物質(zhì)，研究Cd(II)對PAHs高效降解菌Bacillussp. P1在降解菲過程中產(chǎn)酶過程的影響及其對酶促降解性能的影響，以期為探明Cd(II)對Bacillussp. P1降解PAHs的影響機理提供依據(jù)．

1 材料與方法

蛋白的濃度可以表征體系中酶量的多少，測得含Cd(II)體系和無Cd(II)體系降解菌產(chǎn)生的蛋白濃度的差異可以表征Cd(II)對降解菌產(chǎn)酶總量的影響．鄰苯二酚2,3-雙加氧酶在細菌開環(huán)降解菲過程中起關(guān)鍵作用[8]，測得含Cd(II)體系和無Cd(II)體系降解菌所產(chǎn)生的粗酶液中其酶活的差異可以表征Cd(II)對降解菌產(chǎn)酶的酶活影響．此外，酶促降解過程中菲降解率的變化是反應Cd(II)對酶促降解過程影響的直接參數(shù)．因此本研究分別從蛋白濃度的變化、粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活的變化及酶促降解過程菲降解率的變化3個方面來考察Cd(II)對降解菌產(chǎn)酶過程的影響及其對酶促降解過程的影響．

1.1 菌種來源

從長期受PAHs污染的污泥中(以PAHs為唯一碳源)篩選出的細菌Bacillussp. P1[9]，經(jīng)PCR擴增其16S rDNA后鑒定，該菌種與Bacillusmalacitensisstrain CECT 5687的同源性高達100%.

1.2 Cd(II)對Bacillus sp. P1產(chǎn)酶的影響

1.2.1 胞外酶及胞內(nèi)酶的提取

1)降解菌的培養(yǎng)條件

配制一定體積的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,分裝入幾個250 mL錐形瓶中,每瓶100 mL,以八層紗布封口,放入高壓滅菌鍋121 °C滅菌30 min.將高壓滅菌后的錐形瓶置于無菌室,紫外燈照射滅菌20 min．在無菌條件下,將保存于斜面中的Bacillussp. P1菌種接種于三角瓶內(nèi)，30 °C，150 r/min條件下好氧振蕩培養(yǎng)48 h．

2)胞外酶、胞內(nèi)酶的提取方式

將降解菌Bacillussp. P1的培養(yǎng)液在4 °C，9 000 r/min條件下離心，收集上清液，即為胞外粗酶液．將分離出的沉淀(菌體)置入0.05 M的磷酸鹽緩沖液中反復振蕩洗滌，9 000 r/min條件下離心，重復3次．將收集到的菌體再次置于0.05 M磷酸鹽緩沖液中，制成菌懸液，將其置于0 °C冰水混合浴中，用超聲波破碎儀(XO-1000D，南京舜瑪)間歇破碎細胞10 min(300 W, 3 s/8 s)．在4 °C下9 000 r/min離心10 min，上清液即為胞內(nèi)粗酶液[10]．

1.2.2 降解菌產(chǎn)酶的SDS-PAGE分析測定

本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法探究在降解菲的過程中Cd(II)對降解菌Bacillussp. P1所產(chǎn)生的酶的組成和數(shù)量的影響．主要試驗方法如下：將12%的分離膠(H2O 3.3 mL，30%丙烯酰胺4.0 mL，1.5 mol/L Tris-HCl 2.5 mL，10%十二烷基苯磺酸鈉0.1 mL，10%過硫酸銨0.1 mL，TEMED 6 μL)灌入兩塊玻璃板間，待凝膠形成后在分離膠上層灌入5%的濃縮膠(H2O 2.7 mL，30%丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol/L Tris-HCl 0.5 mL，10%十二烷基苯磺酸鈉40 μL，10%過硫酸銨40 μL，TEMED 4 μL)，并插入樣品梳．待濃縮膠凝聚后，在電泳槽(Bio-Rad)中倒入電泳緩沖液，取出樣品梳．在每個凹形凝膠樣品槽中注入10 μL樣品或標準蛋白marker．電泳結(jié)束后，將膠片用考馬斯亮藍染色，用脫色劑脫色后觀察[11]．使用Gelpro軟件對蛋白條帶進行分析．樣品為分別從在僅含菲(60 mg/L)的無機鹽培養(yǎng)基((MnSO40.0447 mg/L, ZnSO40.068 6 mg/L, (NH4)6MO7O24·4H2O 0.034 7 mg/L, K2HPO4129.15 mg/L, Na2HPO4167 mg/L, KH2PO443.5 mg/L, NH4Cl 25 mg/L, MgSO413.8 mg/L, CaCl236.4 mg/L, FeCl30.42 mg/L)中培養(yǎng)的菌和從在菲與Cd(II)共存的無機鹽培養(yǎng)基(菲濃度為60 m/L；Cd(II)濃度分別為50, 100, 150,200,300 mg/L)中培養(yǎng)的菌中提取出的胞外(胞內(nèi))酶，經(jīng)鹽析和透析后所得．

1.3 Cd(II)對Bacillus sp. P1粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活的影響

將Bacillussp. P1分別在僅含菲(60 mg/L)和菲與Cd(II)共存的無機鹽培養(yǎng)基中(菲濃度為60 m/L；Cd(II)濃度分別為50, 100, 150,200,300 mg/L)培養(yǎng)，3 d后提取粗酶液．在375 nm (UV 2550，SHIMADZU)波長下測定鄰苯二酚2,3-雙加氧酶活性．每個測試樣品中含2.4 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 M)，0.4 mL 鄰苯二酚(20 μM)及0.2 mL粗酶液[12]．定義每分鐘1 μmol底物轉(zhuǎn)化所需的酶量為1個酶活力單位U．

1.4 Cd(II)對酶促降解菲的影響

pH及溫度均是影響酶促降解過程的重要因素．過酸或過堿的環(huán)境都會影響酶促降解性能．溫度過高或者過低也會影響酶促反應的活化能及酶蛋白的結(jié)構(gòu)．本實驗首先確定了酶促降解的較佳pH及溫度條件，在上述條件下探究Cd(II)對酶促降解菲的影響．pH對酶促降解菲影響的試驗方法如下：取系列反應瓶，分別加入20 mL超純水，同時加入菲，使其在瓶中含量均為25 mg/L．用NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液pH分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和9.0．向每個瓶中加入2 mL粗酶液，在30 ℃下振蕩反應30 min后取出．將樣品用正己烷萃取3次，合并萃取液，用紫外分光光度計在254 nm波長下測定菲的吸光度，計算其降解率[13]．同時設(shè)置加入高溫滅活酶的對照組．

溫度對酶促降解菲影響的試驗方法如下：取系列反應瓶，分別加入20 mL超純水，同時加入菲使得其在瓶中含量均為25 mg/L．向每個瓶中加入2 mL粗酶液，分別將其置于25，30，37及45 °C的環(huán)境中，振蕩反應30 min后取出，通過前述同樣的方法萃取、測定、計算菲的降解率．

Cd(II)濃度對菲酶促降解影響的試驗方法如下：取6個反應瓶，分別往其中加入50 mL超純水，同時加入菲使其在瓶中的含量分別為5 mg/L．向各瓶中(1號瓶除外)加入Cd(II)，使1～6號瓶中的Cd(II)濃度分別為0，50，100，150，200，300 mg/L．再分別往各瓶中加入2 mL粗酶液后,調(diào)節(jié)pH及溫度為1.4前述部分所確定的酶促降解的較佳pH及溫度，振蕩反應30 min．隨后將瓶中所有試樣分別用正己烷萃取3次，將萃取液在紫外分光光度計下254 nm波長處測定菲的吸光度，計算其降解率．本研究中所有體系均設(shè)置3個平行樣．

2 結(jié) 果

2.1 Cd(II)對Bacillus sp. P1產(chǎn)酶的影響

Cd(II)對Bacillussp. P1產(chǎn)酶的影響如圖1所示．圖1(A)和圖1(B)分別表示Cd(II)對Bacillussp. P1產(chǎn)胞外蛋白和胞內(nèi)蛋白的影響．圖中的a，b，c，d泳道分別表示在0，50，100，150 mg/L Cd(II)濃度下，細菌在降解菲過程中產(chǎn)生的蛋白的變化．經(jīng)Gelpro軟件分析可知，胞外及胞內(nèi)蛋白的總濃度隨Cd(II)濃度增加而逐漸減小，胞外、胞內(nèi)蛋白條帶總濃度分別由8.37×106，1.54×107降至5.49×106，6.01×106(Gelpro軟件分析值)．胞外、胞內(nèi)蛋白中含鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的33-45 kD蛋白條帶的濃度也依次減小，分別由4.31×105，5.66×106降至2.39×105，4.78×104．此外，胞外蛋白中小分子蛋白(分子量<20 kD)受較高濃度(150 mg/L)Cd(II)影響較大，該區(qū)域條帶幾乎已完全丟失．

圖1 Cd(II)對Bacillus sp. P1產(chǎn)生的蛋白的影響

2.2 Cd(II)對Bacillus sp. P1粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的影響

Cd(II)對Bacillussp. P1粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活的影響如圖2所示．Cd(II)對Bacillussp.P1胞外及胞內(nèi)粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的酶活均有抑制作用，且在Cd(II)濃度為100～300 mg/L范圍內(nèi)，抑制作用均十分顯著(p<0.05)．當Cd(II)濃度由0 mg/L增大至300 mg/L，胞外及胞內(nèi)酶中的鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活分別由266.96，886.30 U/mg下降至38.93，290.26 U/mg．

Cd(II)濃度/(mg·L-1)

2.3 Cd(II)對菲酶促降解過程的影響

在胞外、胞內(nèi)酶酶促降解菲的過程中，隨著pH增大，菲的降解率均呈先增大后減小的趨勢．當pH為7時，胞外酶對菲的降解率達到最大值88.06%；當pH為6時，胞內(nèi)酶對菲的降解率達到最大值97.21%．由圖還可以看出，在試驗的整個pH范圍內(nèi)，胞內(nèi)酶酶促降解菲的效率均高于胞外酶酶促降解菲的效率，這表明，相同pH條件下，胞內(nèi)酶酶促降解菲的能力強于胞外酶酶促降解菲的能力．此結(jié)論同時映證了圖1和圖2所反映的結(jié)果，表明細菌在降解菲的過程中，其分泌到胞外起作用的酶量少于胞內(nèi)酶酶量．同時，胞內(nèi)粗酶液中一些關(guān)鍵開環(huán)酶(如鄰苯二酚2,3-雙加氧酶)的酶活大于胞外粗酶液中關(guān)鍵開環(huán)酶的酶活．由此得知，Cd(II)影響粗酶液中酶量的多少及其中關(guān)鍵開環(huán)酶的酶活大小是其對菲的酶促降解過程產(chǎn)生影響的內(nèi)在機制．

pH

溫度對菲酶促降解過程的影響如圖4所示．在37 ℃時，胞外酶和胞內(nèi)酶的酶促降解能力最強，對菲的降解率分別為81.81%和99.81%．在一定溫度范圍內(nèi)，酶保持較高降解活性，且酶促降解性能隨溫度的升高而增大．隨溫度增高，酶活性提高；同時，菲在水中的溶解性也會增大，使得其與酶的接觸面積增大，提高了其降解率[14]．然而過高的溫度則會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，從而降低酶的活性，菲的降解率逐漸降低．

溫度/℃

在確定菲酶促降解的較佳溫度和pH的基礎(chǔ)上，研究該條件下重金屬對菲酶促降解過程的影響．Cd(II)對胞外和胞內(nèi)酶酶促降解菲的影響如圖5所示．由圖可見，在各酶促降解體系中菲的降解率均高于64.58%，而高溫滅活酶對照組(未在圖中表示)中菲的降解率為2.83%，表明體系中菲減少的主要原因是酶的作用．在胞外和胞內(nèi)酶降解菲的過程中，Cd(II)的出現(xiàn)均抑制了菲的降解，隨著Cd(II)濃度從0 mg/L增大到300 mg/L，菲的降解率分別從79.86% 降至64.59%，87.96%降低至74.83%．且Cd(II)濃度為300 mg/L時，抑制作用最顯著(p<0.05)．

Cd(II)濃度/(mg·L-1)

3 討 論

由于Cd(II)的作用，降解菌在降解菲過程中產(chǎn)生的胞外和胞內(nèi)酶的濃度和活性均發(fā)生了改變，其中300 mg/L Cd(II)條件下胞內(nèi)酶中關(guān)鍵開環(huán)酶鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活(290.26 U/mg)比不存在Cd(II)條件下的(886.30 U/mg)降低了67.25%．這可能是由于：1)Cd(II)通過阻礙細胞分裂而抑制了降解菌的生長，降解菌數(shù)量的降低減少了體系中酶的產(chǎn)生總量[15]．2)Cd(II)影響降解菌的生理生化過程從而影響其酶的產(chǎn)生及酶的組成和活性．有研究表明，Cd(II)能夠刺激細胞產(chǎn)生活性氧基團ROS，導致細胞的過氧化狀態(tài)形成，從而損害細胞膜[16]；也有研究表明，Cd(II)能穿透細胞壁和細胞膜表面蛋白進入細胞內(nèi)而影響細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[17]．

Cd(II)對降解菌胞外、胞內(nèi)酶酶促降解菲的過程具有抑制作用，且隨Cd(II)濃度由0 mg/L增大到300 mg/L，抑制作用逐漸增強，胞外和胞內(nèi)酶酶促降解菲的降解率分別由79.86%，87.96%降至64.59%，74.83%．酶促降解菲主要是通過形成酶-底物化合物或者通過降低反應過程中的活化能來催化菲的開環(huán)從而使之降解[18]．無機鹽培養(yǎng)基中的常量金屬(Mg2+和 Ca2+等)會作為酶活性中心的一個必需組分，通過形成酶-金屬-底物復合物來參與催化作用[19]．而重金屬Cd(II)會與環(huán)境中的這些常量金屬競爭酶的結(jié)合位點從而使得催化作用降低，導致降解性能減弱．同時，重金屬Cd(II)對酶產(chǎn)生毒害作用，它們能與蛋白中的巰基(-SH)結(jié)合，從而破壞其結(jié)構(gòu)[20]．

4 結(jié) 論

1)Cd(II)影響降解菌Bacillussp. P1在降解菲過程中酶的產(chǎn)生過程，導致其蛋白的組成、濃度及活性發(fā)生變化；此外，Cd(II)影響降解菌Bacillussp. P1所產(chǎn)生的酶的酶促降解能力．Cd(II)對降解菌產(chǎn)酶及酶促降解過程的影響是其影響多環(huán)芳烴降解菌降解能力的重要機制．

2)Cd(II)抑制降解菌的產(chǎn)酶過程．胞外和胞內(nèi)酶的蛋白濃度均在Cd(II)出現(xiàn)后有所降低，且隨著Cd(II)濃度的增加，其對酶產(chǎn)生的抑制作用逐漸增強．在無Cd(II)條件下和Cd(II)為300 mg/L條件下培養(yǎng)的降解菌胞外(胞內(nèi))粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活分別為266.96 U/mg(886.30 U/mg)，38.93 U/mg(290.26 U/mg)．

3)Cd(II)抑制降解菌所產(chǎn)生的酶酶促降解菲的過程，隨Cd(II)濃度從0 mg/L增加到300 mg/L，其酶促降解菲的能力逐漸減弱，胞外和胞內(nèi)酶酶促降解菲的降解率分別由79.86%降至64.59%，由87.96%降低至74.83%．

[1]TEJEDA-AGREDANO M C, GALLEGO S, VILA J,etal. Influence of the sunflower rhizosphere on the biodegradation of PAHs in soil[J]. Soil Biol Biochem, 2013, 57: 830-840.

[2]XU F L, QIN N, ZHU Y,etal. Multimedia fate modeling of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in lake Small Baiyangdian, Northern China[J]. Eco Model, 2013, 252(10): 246-257.

[3]DEBRUYN J M, MEAD T J, SAYLER G S,etal. Horizontal transfer of PAH catabolism genes in Mycobacterium: evidence from comparative genomics and isolated pyrene-degrading bacteria[J]. Environ Sci Technol, 2012, 46(1): 99-106.

[4]WANG J, CHEN C. Biosorbents for heavy metals removal and their future[J]. Biotechnol Adv, 2009, 27(2): 195-226.

[5]LORENZ N, HINTEMANN T, KRAMAREWA T ,etal. Response of microbial activity and microbial community composition, in soils to long-term arsenic and cadmium exposure[J]. Soil Biol Biochem, 2006, 38(6): 1430-1437.

[6]RIPPEY B, ROSE N, YANG H,etal. An assessment of toxicity in profundal lake sediment due to deposition of heavy metals and persistent organic pollutants from the atmosphere[J]. Environ Int, 2008, 34(3): 345-356.

[7]JANBANDHU A, FULEKAR M H. Biodegradation of phenanthrene using adapted microbial consortium isolated from petrochemical contaminated environment[J]. J Hazard Mater, 2011, 187(1/3): 333-340.

[8]曹曉星. 多環(huán)芳烴降解菌的共代謝及其相關(guān)酶的研究[D]. 廈門:廈門大學，2006：12-13.

CAO Xiao-xing. Study of co-metabolism and enzyems of polycyclic aromatic hydrocarbons-degrading bacteria[D]. Xiamen: Xiamen University, 2006:12-13. (In Chinese)

[9]牛秋雅，曾光明，牛一樂, 等. 生物強化堆肥降解菲[J]. 湖南大學學報:自然科學版，2009, 36(2): 85-88.

NIU Qiu-ya, ZENG Guang-ming, Niu Yi-le,etal. Removal of phenanthrene by acclimatizing activated sludge[J]. Journal of Hunan University: Natural Sciences, 2009, 36(2): 85-88. (In Chinese)

[10]吳蔓莉. 兩株優(yōu)勢菌株對多環(huán)芳烴的降解機理研究[D]. 西安: 西安建筑科技大學，2010：25-26.

WU Man-li. Study of biodegradation mechanism of polycyclic aromatic hydrocarbon using two superior strains[D]. Xi’an: Xi’an University of Architecture and Technology, 2010:25-26. (In Chinese)

[11]汪家政. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2000:77-110.

WANG Jia-zheng. Technical manual of protein[M]. Beijing: Science Press, 2000:77-110. (In Chinese)

[12]GUZIK U, GRE- I, WOJCIESZY-SKA D,etal. Isolation and characterization of a novel strain of Stenotrophomonas maltophilia possessing various dioxygenases for monocyclic hydrocarbon degradation[J]. Braz J Microbiol, 2009, 40(2): 285-291.

[13]吳曼莉，聶麥茜，王曉昌, 等. 金屬離子對多環(huán)芳烴酶促降解的影響作用[J]. 水處理技術(shù)，2008, 34(8): 13-16.

WU Man-li, NIE Mai-qian, Wang Xiao-chang,etal. Study on enzymatic degradation and enhancement of coarse endoenzyme activityexcreted fromflavobacteriumsp FCN2[J]. Technology of Water Treatment, 2008, 34(8): 13-16. (In Chinese)

[14]BAMFORTH S M, SINGLETON L. Review: Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons: current knowledge and future directions[J]. J Chem Technol Biot, 2005, 80(7): 723-736.

[15]SU H L, CHOU C C, HUNG D J,etal. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay[J]. Biomaterials, 2009, 30(30): 5979-5987.

[16]KE L, LUO L J, WANG P,etal. Effects of metals on biosorption and biodegradation of mixed polycyclic aromatic hydrocarbons by a freshwater green algaSelenastrumcapricornutum[J]. Bioresour Technol, 2010, 101(18): 6950-6961.

[17]HOMA J, STüRZENBAUM S R, MORGAN A J,etal. Disrupted homeostasis in coelomocytes of Eisenia fetida and Allolobophora chlorotica exposed dermally to heavy metals[J]. Euro J Soil Bio, 2007, 43: 273-280.

[18]PARK E S, SHIN J S. Free energy analysis of ω-transaminase reactions to dissect how the enzyme controls the substrate selectivity[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2011, 49(4): 380-387.

[19]PURICH D L. Enzyme kinetics: catalysis & control[M]. US: Elsevier Press, 2010, 335-378.

[20]GUO H J, LUO S L, CHEN L,etal. Bioremediation of heavy metals by growing hyperaccumulaor endophytic bacteriumBacillussp. L14[J]. Bioresour Technol, 2010, 101(22): 8599-8605.