己酮可可堿對小鼠酒精性肝病酒精代謝酶和核受體PPAR-α的影響*

屈耀寧，董 蕾，史海濤，秦 斌，劉亞萍

因大量飲酒導致的酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）在西方國家是導致死亡的主要疾病之一[1]。在我國，ALD的發病也呈逐漸增長的趨勢。據調查，1982年我國成人嗜酒者為0.21%，1991年北京市16個縣區調查結果為14.3%，2000年浙江地區調查結果為14.8%，西安地區飲酒者占35.1%[2]。乙醇在肝內通過細胞質乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH)、微粒體細胞色素 P4502E1（CYP2E1）和過氧化物酶代謝，其中ADH和CYP2E1是乙醇代謝的主要酶類[3]。乙醇在肝內代謝主要通過胞漿中ADH途徑和內質網的微粒體乙醇氧化系統（MEOS）途徑，生成乙醛，再經過乙醛脫氫酶生成乙酸，代謝為水和二氧化碳。在MEOS途徑中CYP2E1活化產生的活性氧基團（ROS）是損傷肝臟的主要原因之一[4]。過氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPAR-α）是近年來廣泛研究的調控脂肪酸轉化和氧化的核轉錄因子[5]，能有效地調控炎性因子的表達及氧化應激反應，參與酒精性肝損傷的發展過程并發揮關鍵性作用。目前，關于己酮可可堿（pentoxifylline，PTX）對ALD的治療作用研究已有報道，但大多僅限于臨床觀察，很少涉及作用機制方面的研究。為了進一步探討PTX對ALD的防治作用，我們制備了酒精誘導的C57BL/6小鼠ALD模型，檢測小鼠血清 ADH、CYP2E1酶活性和肝組織 ADH、CYP2E1、PPAR-α mRNA水平，以及肝組織CYP2E1和PPAR-α蛋白表達，以探討PTX對ALD的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雌性C57BL/6小鼠64只，體質量（20±4）g，由我校動物中心提供。室溫保持在（22±2）℃，相對濕度為65%，按正常晝夜節律調整光照時間。

1.2 急性酒精性肝損傷模型的制備 取28只小鼠，隨機分為模型組、治療組和正常組，每組8～10只。治療組動物提前7天給予PTX（Sigma公司 P1784-10G）100 mg·kg-1體質量腹腔注射，1次/d；模型組和正常組動物給予等量0.9%生理鹽水腹腔注射。7天后，給予模型組和治療組動物50%乙醇12 ml·kg-1體質量灌胃，q12h，連續3次[6]；給予正常組等量5%葡萄糖溶液灌胃。在灌胃結束后，隨機處死模型組動物2只，取肝組織行病理學檢查。在光鏡下見肝小葉大量炎細胞浸潤，并有空泡和肝細胞壞死，證明模型建立成功。

1.3 慢性酒精性肝炎模型的制備 取36只小鼠，隨機分為模型組、小劑量、大劑量治療組和正常組，每組8～10只。分別給予治療組動物PTX 50 mg·kg-1體質量和150 mg·kg-1體質量腹腔注射，1次/d，給予模型組和正常組等量0.9%生理鹽水腹腔注射。2 h后，給予模型組、小劑量和大劑量治療組動物10%乙醇10 ml·kg-1體質量灌胃，1次 /d，1周后，給予20%乙醇 10 ml·kg-1體質量灌胃，1次 /d，參考文獻[7]，給予正常組等量5%葡萄糖溶液灌胃，造模及給藥時間均為6周。6周后，隨機處死模型組動物2只，行病理學檢查證明模型建立成功。造模及給藥結束后，小鼠禁食不禁水12 h，眼球采血，分離血清，保存于-20℃。采取脫臼法處死小鼠，取肝臟右葉于無菌凍存管，經液氮罐轉移至-80℃冰箱保存。取肝左葉置于甲醛液中固定，行病理學檢查。

1.4 血清ADH和CYP2E1活性測定 采用比色法檢測（南京建成科技有限公司提供試劑，批號A083-1 GMS18021.1）。

1.5 肝組織 ADH、CYP2E1和 PPAR-α mRNA水平測定 取肝組織塊各約5 mg，用試劑盒RNAfast200（上海飛捷生物技術有限公司 Catalog no.220010）提取總RNA,采用反轉錄試劑盒（TaKaRa Biotechnology）反轉錄為cDNA。由北京鼎國昌盛生物技術公司設計并合成引物（表1）。mRNA水平和對照組無明顯差異（P>0.05）；在急性和慢性酒精性肝炎小鼠肝組織CYP2E1 mRNA水平明顯增高，與對照組相比有顯著性差異（P<0.01），而治療組比模型組明顯降低（P<0.01）；在急性酒精性肝炎、治療組和對照組小鼠肝組織PPAR-α mRNA水平無顯著性差異（P>0.05），慢性酒精性肝炎小鼠肝組織PPAR-α mRNA水平降低，與對照組相比有統計學意義（P<0.05，圖1、2）。

表1 引物序列

圖1 急性肝損傷小鼠肝組織ADH、CYP2E1和PPAR-αmRNA水平

1.6 肝組織CYP2E1和PPAR-α蛋白表達檢測 采用免疫組化法。經過脫蠟、抗原修復、封閉、加一抗（1:100，博士德生物 BA1774 BA1691），4°過夜，加二抗（中杉金橋SP-9000/9001/9002），顯色，蘇木素復染、封片。陽性染色細胞為胞漿和/或胞膜出現黃褐色物質。

1.7 統計學處理 采用SPSS18.0統計學軟件，計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為有統計學差異，P<0.01為有顯著性統計學差異。

2 結果

2.1 小鼠血清ADH和CYP2E1活性變化 見表2。

表2 各組小鼠血清ADH和CYP2E1活性(U/ml，±s）比較

表2 各組小鼠血清ADH和CYP2E1活性(U/ml，±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；②P＜0.01

數量 ADH CYP2E1急性肝炎 811.2±1.612.2±1.8①治療組 811.5±1.28.1±1.5對照組 812.5±1.27.9±1.4慢性肝炎 85.8±1.4① 11.8±1.7②小劑量PTX 86.9±2.6② 10.2±1.5大劑量PTX 84.6±1.77.8±1.5①對照組 84.3±0.66.5±1.2

2.2 肝組織 ADH、CYP2E1和 PPAR-α mRNA水平變化 急性和慢性酒精性肝炎小鼠肝組織ADH

圖2 慢性酒精性肝炎小鼠肝組織ADH、CYP2E1和PPAR-αmRNA水平

2.3 肝組織CYP2E1和PPAR-α蛋白表達變化 采用Image-Pro Plus6.0圖像處理軟件計算陽性細胞表達量，結果在急性和慢性酒精性肝炎動物肝組織CYP2E1陽性細胞表達數比對照組明顯增多[分別為（765±21）對（308±12）和（682±25）對（305±18），P<0.01]，而大劑量治療組分別為（521±18）和（418±12），顯著低于模型組（P<0.01）；急性和慢性酒精性肝炎動物肝組織PPAR-α陽性細胞表達比對照組明顯減少[分別為（322±15）對（721±18）和（262±23）對（689±14），P<0.01]，而大劑量治療組分別為（548±20）和（725±19），顯著高于模型組（P<0.01，圖3、4、5和 6）。

圖3 急性肝損傷小鼠肝組織CYP2E1蛋白表達 陽性細胞主要位于胞漿，分別呈彌漫或散在分布（SP，40×）A：模型組；B：治療組；D：對照組

圖4 急性肝損傷小鼠肝組織PPAR-α蛋白表達 陽性細胞主要位于胞核，分別呈彌漫或散在分布(SP，40×）A：模型組；B：治療組；D：對照組

圖5 慢性酒精性肝炎小鼠肝組織CYP2E1蛋白表達 陽性細胞主要位于胞漿，分別呈彌漫或散在分布(SP，40×）A：模型組；B：小劑量治療組；C：大劑量治療組；D：對照組

圖6 慢性酒精性肝炎小鼠肝組織PPAR-α蛋白表達 陽性細胞主要位于胞核，分別呈彌漫或散在分布(SP，40×）A：模型組；B：小劑量治療組；C：大劑量治療組；D：對照組

3 討論

PTX為甲基黃嘌呤化合物，是一種磷酸二酯酶抑制劑[8]，可提高細胞內c-AMP水平。因改善血流變、擴血管、改善細胞缺氧、抗炎、抗氧化和調節免疫等作用[9]，已被證實能預防和改善肝纖維化、肺纖維化、脂肪肝、腦缺血。目前，關于PTX對ALD的作用已有報道，比如療效的觀察等[10～12]，研究表明，PTX確實可以改善ALD患者病情，但對其具體作用機理的研究尚未見報道。我們推測PTX改善ALD的機制可能與ADH無關。

國內外大量研究已經證實，CYP2E1的活化在ALD的發生發展中有著極其重要的作用[13]。

CYP2E1的活化是乙醇導致酒精性肝損傷和肝纖維化的原因[14]。Zanelli等證實，乙醇能夠延緩CYP2E1的降解[15]。MEOS是乙醇代謝的另一重要途徑，當肝組織中乙醇濃度超過10 mmol/L時，MEOS被激活并對乙醇代謝起主要作用。乙醇在體內代謝產生大量ROS，通過傳遞電子，氧化大分子物質，引起肝細胞脫氧核糖核酸損傷、蛋白質和脂質氧化損傷[16]。實驗中模型組CYP2E1 mRNA和蛋白水平均明顯增高，而治療組顯著降低，表明CYP2E1是ALD的一種損傷性蛋白。我們推測，PTX可能減少了乙醇代謝過程中ROS的產生。

PPAR是一類能被配體激活的核轉錄因子[17]，目前已知有三種亞型，即α、β和γ，在各種組織中表達不同[18]。PPAR-α高表達于線粒體豐富和β氧化活性高的組織。PPAR-β高表達于脂肪組織，PPAR-γ幾乎均低表達于各種組織[19]。PPAR-α是近年來廣泛研究的調控脂肪酸轉化和氧化的核轉錄因子[20]，還可以調節炎癥反應和免疫反應等。大量文獻證明PPAR-α缺失或降低會導致肝臟脂肪變和炎癥反應。細胞學實驗表明，乙醛能夠抑制PPAR-α與其DNA和某些配體的結合能力。實驗中乙醇暴露后，小鼠肝臟PPAR-α蛋白水平顯著降低，PTX治療增加了PPAR-α蛋白的表達水平，并且在長期乙醇暴露后PPAR-α mRNA水平也降低。這一結果表明，PPAR-α是ALD的一種保護性蛋白，且PTX改善ALD的作用與其對PPAR-α的活化有關。我們推測，PTX可能因其抗氧化作用減少了乙醛的生成量，并且削弱了酒精對PPAR-α及某些脂肪氧化酶表達的抑制，從而阻止了ALD的發生和發展。

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