鴉膽子油注射液對H22細胞增殖的抑制作用及其機制探討

宋艷麗，薛 瑞，吳 倩，張玉潔

鴉膽子是苦木科植物鴉膽子的成熟果實，出自于《本草綱目拾遺》，性味苦，寒，有毒，其能燥濕、解毒、殺蟲，治療痢疾，抗瘧，扁平疣等[1]。鴉膽子油注射液是以鴉膽子仁石油醚提取物和精制大豆磷脂為原料制成的水包油型乳劑，研究發現其既有抗腫瘤作用還有免疫保護作用，聯合放化療治療對機體免疫功能有促進作用，并可降低放化療所伴隨的毒性作用，提高患者的生活質量和對治療的依從性[2～4]。有體外實驗研究提示，鴉膽子油注射液可抑制膀胱癌、肺癌、食管癌和宮頸癌等細胞的增殖，并促進細胞凋亡[5，6]，但對其作用機制方面的研究較少。本研究擬觀察鴉膽子油注射液在體內外對H22肝癌細胞的抑制作用及其作用機制，為其臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物與試劑 肝癌H22細胞由華中科技大學同濟醫學院提供；ICR小鼠，體質量（20±2）g，雌雄兼用，由襄陽醫學院動物實驗中心提供；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）；RPMI 1640培養粉（Gibco公司）；順鉑（江蘇豪森藥業股份有限公司）；MTT和胰蛋白酶（Sigma公司）；ELx800型酶聯免疫檢測儀（BIO-TEK公司）；CO2孵箱（JOUAN公司）；定量檢測腫瘤壞死因子-α的酶聯免疫試劑盒（上海森雄科技實業有限公司）；檢測125I-轉化生長因子-α的放射免疫分析藥盒（北京普爾偉業生物科技有限公司）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 H22細胞增殖檢測 采用MTT法，取對數生長期的H22細胞，常規消化、洗滌后，調整細胞濃度至1×105/ml，接種于96孔培養板中，于 5%CO2、37℃孵箱中培養24 h后，分別加入不同濃度的鴉膽子油注射液或順鉑各100μl，對照孔加入等容積的1640培養液，每組設6個復孔，培養48 h后按常規采用酶標儀（波長570 nm）測定各孔吸光度值(A)。按公式“（1-藥物孔A值/對照孔A值）×100%”計算細胞抑制率。

1.3 荷H22移植瘤小鼠模型的建立 按文獻[7]方法，用滅菌NS調整瘤細胞數至1×107/ml，計數活細胞數為98%以上可用。取ICR小鼠，除正常對照組外，其他組小鼠皆接種瘤細胞懸液0.2 ml于右腋窩皮下。在24 h后，隨機分為荷瘤陰性對照組、5-Fu處理組和鴉膽子油處理組，每組10只。在正常對照組，給予生理鹽水0.2 ml灌胃，1次/d；給予荷瘤小鼠5-Fu 25 mg·kg-1·d-1或鴉膽子油 12.5 mg·kg-1·d-1、25 mg·kg-1·d-1和 50 mg·kg-1·d-1腹腔注射，皆連續給藥 10 d。于停藥后次日，自小鼠眼球采血后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，分別取腫瘤、脾臟和胸腺，稱重。按以下公式計算抑瘤率和臟器指數：抑瘤率=（荷瘤組瘤質量-給藥組瘤質量）/荷瘤組瘤質量×100%；脾臟指數=脾臟質量（mg）/體質量（g）；胸腺指數=胸腺質量（mg）/體質量（g）。

1.4 脾細胞增殖檢測[8]停藥后次日頸椎脫臼處死小鼠，無菌操作條件下取出脾臟，剪碎，Hanks液洗滌，經200目銅網過濾，離心，去上清，加入2 ml雙蒸水，滴管吹打30 s，立即加入1.8%氯化鈉溶液2 ml，離心，去上清，再加入Hanks液洗滌，直至溶液無紅色，即為各組脾細胞懸液。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞數為1×107/ml，向脾細胞中加入Con A（或LPS），使ConA（或LPS）的終濃度為5μg/ml（或10μg/ml）。取上述細胞懸液200μl，加入96孔培養板，設只加ConA（或LPS）的對照孔。將培養板置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養箱中培養48 h。在結束培養前4 h加入MTT，繼續培養4 h后加入酸化異丙醇終止反應，振蕩10 min使充分溶解，用酶標儀于570 nm處測定各孔的OD值。

1.5 動物血清細胞因子的測定 按照試劑盒說明書采用ABC-ELISA法測定TNF-α；采用放射免疫法測定TGF-α。

1.6 統計分析 采用Office 2007和SPSS15.0進行統計分析。計量資料以（±s）表示，多樣本比較采用Dunnett檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 對H22細胞增殖的抑制作用 鴉膽子油在10～160μg·ml-1濃度范圍內對H22細胞的體外增殖具有抑制作用，并具有濃度依耐性（表1）。

表1 鴉膽子油對H22細胞增殖（±s，n=6）的抑制作用

表1 鴉膽子油對H22細胞增殖（±s，n=6）的抑制作用

與對照組比，①P<0.05

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2.2 對荷瘤小鼠瘤質量的影響 在給予5-Fu（25 mg·kg-1）腹腔注射10 d后可明顯抑制荷瘤小鼠的瘤質量，與模型組比具有非常顯著性差異（P<0.05）；在給予鴉膽子油 12.5 mg·kg-1、25 mg·kg-1和 50 mg·kg-1灌胃后，均可不同程度地減輕荷瘤小鼠的瘤質量，與模型組比均具有非常顯著性差異（P<0.05，表2）。

表2 荷瘤小鼠瘤質量（g，±s，n=10）的變化

表2 荷瘤小鼠瘤質量（g，±s，n=10）的變化

與荷瘤動物比，①P<0.05

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2.3 對荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響 荷瘤動物脾臟指數和胸腺指數增加，與正常對照組比，具有顯著性差異（P<0.05），而5-Fu和三個劑量鴉膽子油處理對脾臟指數和胸腺指數的影響較小（表3）。

表3 荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數（±s，n=10）的變化

表3 荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數（±s，n=10）的變化

與對照組比，①P<0.05

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2.4 對荷瘤小鼠脾細胞增殖的影響 與對照組比，荷瘤動物脾細胞增殖受到抑制（P<0.05）；與荷瘤動物比，在5-Fu腹腔注射后脾細胞增殖水平仍然低下；與荷瘤動物比，鴉膽子油體內給藥可促進脾細胞增殖（P<0.05，表4）。

表4 荷瘤小鼠脾細胞增殖（OD值，±s，n=6）的變化

表4 荷瘤小鼠脾細胞增殖（OD值，±s，n=6）的變化

與對照組比，①P<0.05；與荷瘤動物比，②P<0.05

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2.5 對荷瘤小鼠血清TNF-α和TGF-α水平的影響 見表5。

表5 荷瘤小鼠血清TNF-α和TGF-α水平（±s，n=6）的變化

表5 荷瘤小鼠血清TNF-α和TGF-α水平（±s，n=6）的變化

與對照組比，①P<0.05；與荷瘤動物比，②P<0.05

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3 討論

中成藥鴉膽子油注射液已廣泛應用于臨床治療各種惡性腫瘤，其主要的活性成分為不飽和脂肪酸-油酸和亞油酸[9]。鴉膽子油中的油酸和亞油酸與腫瘤細胞膜具有特異的親和力，有很強的抗癌活性[10]。鴉膽子油乳主要成分油酸能抑制拓撲異構酶活性，從而抑制細胞DNA的合成，阻斷癌細胞的增殖[11]。鴉膽子油還可選擇性破壞癌細胞和線粒體等膜性系統，使癌細胞變性壞死，而對正常細胞無損害；其對腫瘤細胞具有靶向性，用藥后藥物濃度濃集，并與癌細胞具有特異性的緊密親和力[12]。本研究結合MTT實驗以及建立荷瘤模型小鼠觀察鴉膽子油注射液對H22細胞增殖的影響，結果表明鴉膽子油體內外均可抑制肝癌H22細胞的增殖，與對照組相比皆具有顯著性差異，且具有濃度依賴性。

腫瘤的發生、發展、預后與人體的免疫功能密切相關，免疫系統作為機體的第一道防線，在惡性轉化細胞的識別和清除過程中發揮著重要作用[13]。機體在發生腫瘤后，免疫系統可通過多種方式對腫瘤細胞發生應答,并清除腫瘤細胞[14，15]。在機體抗腫瘤防御中，T淋巴細胞介導的細胞免疫和B淋巴細胞介導的體液免疫共同發揮著重要作用。脾細胞富含T、B淋巴細胞，在ConA等因素刺激下可增殖分化，參與免疫應答。本研究觀察到，給予鴉膽子油注射液灌胃給藥10天后，可明顯促進由Con A和LPS分別誘導的荷瘤小鼠淋巴細胞增殖，顯示其具有免疫促進作用，但是對脾臟指數和胸腺指數的影響較小。

TNF-α屬腫瘤壞死因子家族，由單核-巨噬細胞、NK細胞、T細胞分泌，能夠激活T淋巴細胞、刺激機體產生抗體和細胞因子，直接殺傷腫瘤細胞而對機體正常細胞無明顯毒害作用；也可通過抑制腫瘤血管生成等間接途徑殺傷腫瘤細胞；還可誘導許多不同來源腫瘤細胞的凋亡，可作為腫瘤復發、轉移的標記物及鑒定腫瘤預后的一項指標[16，17]。TGF-α為表皮生長因子家族成員之一，在多種腫瘤中過度表達。TGF-α可與表皮生長因子受體（EGFR）結合，級聯激活MAPK信號系統，促使DNA合成，從而促使細胞增殖和分化，使腫瘤細胞的生長不受機體的控制，使細胞增殖失控，從而發生癌變[18，19]。TGF-α表達減弱可以加速肝癌細胞凋亡，而其表達增強則會抑制肝癌細胞凋亡。本研究結果顯示，荷瘤模型小鼠血清TNF-α水平明顯降低，TGF-α水平明顯升高，說明小鼠荷瘤以后其免疫功能受到抑制，而在給予鴉膽子油注射液灌胃給藥后，荷瘤小鼠血清TNF-α水平顯著升高，而TGF-α水平明顯降低，提示鴉膽子油可通過促進血清TNF-α表達或/和抑制TGF-α表達，從而增強荷瘤機體的免疫功能。

綜上所述，鴉膽子油體內外均可抑制肝癌H22細胞的增殖，還可提高機體的免疫功能，其調節免疫功能的作用與促進T、B淋巴細胞增殖、上調TGF-α水平以及下調TNF-α水平有關，可能還有其他作用機制，尚需進一步研究。

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