單增李斯特菌非可培養狀態的誘導與PMA-qPCR檢測

,,秀麗，,，*,

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640； 2.廣東省惠州市質量計算監督檢測所，廣東惠州 516000))

單增李斯特菌非可培養狀態的誘導與PMA-qPCR檢測

黃韻1,余以剛1,黃秀麗2，李曉鳳1,肖性龍1，*,吳暉1

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640； 2.廣東省惠州市質量計算監督檢測所，廣東惠州 516000))

在9%(w/v)NaCl條件下,通過溫度、pH兩種因素誘導一株單增李斯特菌進入“活的非可培養”(viable but non-cuturable,VBNC)狀態。通過LIVE/DEAD Baclight活菌檢測試劑盒檢測細菌總數與活菌數,比較單增李斯特菌狀態及數量的差異與變化。結果顯示,在2℃、pH6.0條件下單增李斯特菌活菌全部進入VBNC狀態。用PMA-qPCR對經誘導的四份菌液進行檢測,結果表明該方法能快速、準確地測出死菌背景下的活的單增李斯特菌。

VBNC,PMA,單增李斯特菌,活菌,檢測

單增李斯特菌是一種食源性致病菌,常見于海鮮、生肉、鮮奶等食物中,食用被該菌污染的食物后能引起食物中毒,引發李斯特菌病。單增李斯特菌能在0.5～45℃的溫度范圍內生長,在pH4.7～9.2、高滲透壓條件下仍能繁殖[1]。Bajard等[2]驗證單增李斯特菌在-2℃仍能在肉湯培養基中生長。因此,在低溫條件下仍能保持繁殖的單增李斯特菌對冷鮮、冷藏食品等構成重大威脅。至今已有60多種細菌被證實可進入VBNC狀態[3]。VBNC狀態的細菌具有代謝活性,但無法在常規培養基上生長。這是細菌面臨生存威脅時的一種生存策略[4],而在特定條件下,VBNC菌能恢復繁殖能力及毒性[5]。因此,雖然VBNC狀態的致病菌不具有繁殖能力,但仍對人類健康具有潛在危害。已知能誘導細菌進入VBNC狀態的因素很多[6-10],Besnard等[11]利用自然環境的水,通過調節菌種量、溫度、pH、鹽度、光照等因素,誘導出VBNC狀態的單增李斯特菌,并用CTC-DAPI法、DVC法驗證。Dreux等[12]利用低相對濕度在香菜葉上誘導出VBNC狀態的單增李斯特菌,Cunningham等[13]利用食品防腐劑誘導單增李斯特菌進入VBNC狀態。隨著細菌VBNC狀態概念的提出與證實,傳統方法已不能滿足人們對細菌(尤其是致病菌)的檢測需求。PMA-qPCR技術是近年新興的活菌檢測技術,由Nogva等[14]最先提出。其原理是利用PMA滲入受損細胞膜與DNA結合,通過抑制DNA在PCR反應中擴增達到區分死、活菌檢測的目的。本研究主要通過利用NaCl濃度、pH、溫度幾個因素誘導單增李斯特菌進入VBNC狀態,并嘗試運用PMA-qPCR技術對誘導后的菌液進行檢測,驗證該方法對單增李斯特菌活菌定量檢測的適用性。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

本實驗所用菌株為單增李斯特菌(CMCC34761),為實驗室保存菌種。細菌培養采用腦心浸液肉湯(BHI)培養基(蛋白胨10g/L,脫水小牛腦浸粉12.5g/L,脫水牛心浸粉5g/L,氯化鈉5g/L,葡萄糖2g/L,磷酸氫二鈉2.5g/L),pH7.4±0.2。培養基經過121℃,20min滅菌后使用。將細菌分別接種到30mL BHI液體培養基中于37℃下180r/min搖床中過夜培養20h(OD600≈1)。采用含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)培養基(胰胨17g/L,多價胨3g/L,酵母膏6g/L,氯化鈉5g/L,磷酸氫二鉀2.5g/L,葡萄糖2.5g/L,瓊脂15g/L,pH 7.2～7.4)作為固體培養基,121℃,20min滅菌后使用,用于平板法測可培養菌數。

所用試劑均為化學純或分析純；LIVE/DEAD? BacLightTMBacterial Viability Kit購自 Life Technologies公司(美國)；細菌基因組DNA快速提取試劑盒 購自北京艾德萊生物科技有限公司；PCR Amplification Kit 購自TaKaRa公司。

SPX-250B生化培養箱,高壓蒸汽滅菌鍋 購自上海博訊實業有限公司；水浴鍋 購自雷蒙特實驗設備公司；ESCO生物安全柜 購自浩瀚有限公司；ABI7500熒光定量PCR儀器 購自應用生物系統公司(美國)；鹵鎢燈(650W) 購自 Osram公司(德國)；臺式高速冷凍離心機 購自Eppendorf公司(德國)；多微孔板檢測器Victor3 V 1420 multilabel counter 購自Perkin Elmer公司(美國)。

1.2實驗方法

1.2.1 VBNC狀態的單增李斯特菌的誘導 取生長至對數平臺期的單增李斯特菌菌液30mL于50mL無菌離心管中,9000r/min離心5min,棄上清。用20mL無菌去離子水重懸洗滌菌體三次后,以9% NaCl(w/v)溶液(無菌)重懸于1L錐形瓶。調整細菌濃度為1.8×107CFU/mL,最終菌液體積為500mL。分別調節pH為6.0或7.0(0.1mol/L HCl),分別在2、25℃溫度下進行誘導。誘導過程中利用平板計數法觀察細菌可培養數的變化。由于低氯化鈉濃度對誘導單增李斯特菌進入VBNC狀態具有積極作用,能縮短細菌失去可培養性所需的時間[11],因此實驗中四個誘導液均使用含有9% NaCl(w/v)的無菌水。

為測定細菌可培養數,每次取1mL誘導菌液進行梯度稀釋,吸取100μL稀釋液涂布于TSA-YE固體培養基上,每個濃度設置三次平行實驗,37℃下培養48h后進行計數。在誘導期,當上述方法無菌落檢出時,為確認菌液中是否仍存在可培養細菌,取10mL菌液于無菌離心管中,9000r/min離心5min后用1mL無菌去離子水重懸,并取100μL涂布于TSA-YE固體培養基上培養后觀察。當連續三天平板上無菌落長出時,確認細菌失去可培養性。

1.2.2 細菌總數與活菌數量的測定 細菌總數及活菌數使用LIVE/DEAD? BacLight Bacterial Viability Kit按操作說明書進行定量測定,通過多微孔板檢測器收集熒光強度。死菌數、VBNC菌數計算公式如下,數值均采用三次平行實驗所得的平均數(單位以CFU/mL記,細菌可培養數通過平板計算法測定)：

死菌數=細菌總數-活菌數

不可培養活菌數=活菌數-可培養菌數

1.2.3 PMA-qPCR檢測 誘導期結束后,利用熒光定量PCR檢測熱滅活的死菌以及新鮮培養的單增李斯特菌的細菌總數。通過使用PMA-qPCR技術檢測以上各種菌液中的活菌數。死菌采用熱滅活方法制備,取1mL新鮮的單增李斯特菌菌液,用無菌水洗滌兩次后重懸,調整菌濃度為1.8×107CFU/mL(與誘導液起始濃度一致),于沸水浴中處理2min后取出,并以平板計數法確認無菌落產生。另取1mL新鮮菌液,經兩次無菌水洗滌后重懸,同樣調整細菌濃度為1.8×107CFU/mL,即為活菌樣本。

1.2.3.1 PMA處理 分別取500μL四種誘導的單增李斯特菌、熱滅活的死菌及活菌的菌液于1.5mL離心管中,9000r/min離心3min,等體積無菌水重懸。菌液中加入5mg/mL的PMA儲備液1μL使菌液中PMA終濃度為10μg/mL,充分混勻后,于室溫下暗處孵育10min。將離心管水平放置于冰上,于鹵鎢燈下方20cm處進行5min光照,期間輕輕搖晃冰盒保證溶液得到充分照射。

1.2.3.2 DNA提取以及熒光定量PCR檢測 取500μL經過PMA處理和未經過PMA處理的各誘導菌液于1.5mL無菌離心管中,9000r/min離心5min,按照細菌基因組DNA快速提取試劑盒說明操作提取基因組DNA,作為定量PCR反應模板。用DNAStar Seqman模塊(DNASTAR,Inc)對單增李斯特菌進行基因序列比對、用Primer Express 2.0(Applied Biosystems)設計引物和探針。

上游引物5′-TTC ATC CAT GGC ACC ACC A-3′,

下游引物5′-TAT ACT TAT CGA TTT CAT CCG CGT GT-3′,

探針FAM-5′-CCG CCT GCA AGT CCT AAG ACG CCA-3′-BHQ1。

熒光定量PCR反應體系為25μL,其中含10×(NH4)2SO4緩沖液2.5μL,25mmol/L Mg2+溶液3.5μL,25mmol/L,dNTPs 1μL,15μmol/L前后引物各1μL,10μmol/L探針1μL,模板溶液2μL,Taq DNA聚合酶2.5U,DEPC水12.5μL。反應條件：95℃預變性2min；95℃變性5s,60℃、40s(收集熒光信號),共40個循環。反應結束后40℃保溫2min。每個熒光定量PCR反應各三次平行實驗,計算平均Ct值和樣本標準差SD值。

2 結果與討論

2.1誘導條件的影響

圖1a～圖1d分別給出了在2℃、pH6.0,2℃、pH7.0,25℃、pH6.0及25℃、pH7.0四種不同誘導條件下,誘導期細菌總數、活菌數、細菌可培養數、不可培養活菌數及死菌含量的變化。如圖所示,在誘導過程中,通過平板計數法計算細菌可培養數,除圖1b(2℃,pH6.0條件)的樣本的可培養菌數降為0(90d后)外,圖1a、圖1c、圖1d的可培養菌數在100d誘導期結束后分別為4.3×106、3.3×106、9.3×105CFU/mL左右。

2.2誘導過程中細菌狀態與數量的變化

LIVE/DEAD活菌檢測試劑盒曾被Boulos等[15]用于檢測飲用水中的活菌數與細菌總數。LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測試劑盒中含有兩種核酸染料：SYTO9及PPI(碘化丙啶)。SYTO9染料能穿透細胞膜進入細胞,與DNA結合后發出綠色熒光。PPI不具有細胞膜穿透性,通過滲入膜損傷細胞與DNA結合,發出紅色熒光,而在PPI與SYTO9同時結合細胞DNA的情況下,細胞發出紅色熒光[16]。因此,經試劑盒染料處理后的菌液,其總菌數為紅色熒光細胞與綠色熒光細胞之和,活菌數為發出綠色熒光的細胞總數。

如圖1所示,誘導期結束后,圖1b 2℃,pH6.0的誘導液中,其細菌可培養菌數降為0,而活菌數為1.4×107CFU/mL,說明誘導液中所有的單增李斯特菌進入VBNC狀態。其他三種誘導液中,活菌檢出量分別為1.6×107、7.2×106、5.2×106CFU/mL(依次為圖1a、圖1c、圖1d),而可培養數為4.3×106、3.3×106、9.3×105CFU/mL(依次為圖1a、圖1c、圖1d),活菌檢出量遠大于檢出的可培養菌數,說明三種含有可培養細菌的菌液中,除了可培養出的細菌外,還含有另一部分無法通過培養法檢出的活菌,即VBNC菌。由于四種誘導液中的VBNC菌數量分別為1.2×107、1.4×107、3.9×106、4.3×106CFU/mL(依次為圖1a、圖1b、圖1c和圖1d)。與25℃相比,2℃下有更多的細菌進入VBNC狀態。這可能是相對于常溫來說,2℃低溫使細菌面臨更大的生存壓力,因為進入VBNC狀態是細菌應對外部不利條件時的一種生存策略[4]。然而,在誘導過程中,在控制溫度和pH兩個單一變量的四種情況下,只有在2℃、pH6.0的條件下單增李斯特菌大量、全部進入VBNC狀態,說明單一因素的刺激不足以對細菌進入VBNC狀態有決定性的影響,VBNC菌的形成可能更多的取決于溫度、pH、低濃度氯化鈉以及營養缺乏等各種因素的共同作用。此外,細菌的菌株不同對誘導條件的響應也不盡相同,如Vattakaven等[17]對溶珊瑚弧菌進行VBNC誘導后發現,不同來源的同種細菌,進入VBNC狀態的誘導條件及VBNC狀態的菌數會有差異,而同種細菌不同菌株間對誘導條件的響應也不盡相同甚至相反[11]。因此細菌進入VBNC狀態的成因復雜,至今未有明確的定論。

此外,相對于25℃誘導的菌液,2℃下誘導的菌液中活菌含量更高,說明低溫對提高細菌的存活率有較大影響,可能是因為溶液中含有9% NaCl(w/v),而低溫降低了細胞內部新陳代謝和能量轉換的速度,從而延遲了細胞的損傷。但溫度相同的條件下,pH對活菌水平僅有輕微影響。

2.3單增李斯特菌的PMA-qPCR檢測

利用LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測試劑盒可快速檢測樣本的總菌數和活菌數,然而對于未知樣本,LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測試劑盒無法對其中含有的細菌種類進行鑒別。而熒光定量PCR技術可檢測出樣本中的總菌數,但不能對死菌與活菌含量進行區別檢測。PMA-qPCR聯用技術是近年來快速發展的新型活菌檢測技術,它克服了定量PCR技術的不足,利用PMA滲入膜損傷細胞,與DNA共價結合,從而抑制膜損傷細胞DNA在PCR反應中的擴增,從而實現對樣本中的活菌進行快速的定性與定量檢測[18]。

2.3.1 標準曲線的制定 取新鮮培養、菌濃度為2.3×109CFU/mL(平板計數法檢測)的單增李斯特菌活菌液,使用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA后,對DNA進行0、10、100、1000、10000倍的梯度濃度稀釋。稀釋后的DNA作為熒光定量PCR反應模板制定標準曲線(見圖2)。

圖2 熒光定量PCR標準曲線

2.3.2 PMA-qPCR檢測 對經過PMA處理以及未經過PMA處理的四種誘導的單增李斯特菌、活的單增李斯特菌及死菌經進行DNA提取,得到的DNA作為熒光定量PCR反應模板。各樣本中的細菌總數及活菌數如圖3所示。

圖3 qPCR和PMA-qPCR檢測 不同條件下的單增李斯特菌

從圖3可知,經過PMA處理和未經PMA處理的單增李斯特菌活菌的qPCR反應結果得出的細菌總數、活菌數都與實際值很接近(1.8×107CFU/mL,log(CFU/mL)約為7.26)。而未經PMA處理的死菌,檢出的總菌數與活菌樣本一致,但其活菌數無法檢出,說明PMA可以有效抑制死菌DNA擴增,將PMA與qPCR結合起來的檢測方法可以準確地對樣本總菌數和活菌數進行區別檢測。從圖3可見,四個誘導液樣本中的細菌總數與活菌、死菌中的細菌總數接近,說明單增李斯特菌在經歷誘導后,菌液濃度并未發生較大變化,這與LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測試劑盒的結果是一致的。除此以外,通過PMA-qPCR方法檢出的四種誘導液中的活菌含量與LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測試劑盒檢測的活菌含量也接近,說明PMA-qPCR法能在混合樣本中對活菌進行有效、準確的定量。

3 結論

通過比較與考察兩種溫度、pH對誘導一株單增李斯特菌進入VBNC狀態的作用,發現在缺營養、9%(w/v)NaCl,2℃,pH6.0的條件下可以成功誘導單增李斯特菌進入VBNC狀態,其中低溫是成功誘導的重要條件。PMA-qPCR作為新型活菌檢測技術,可以有效、準確地區分活的單增李斯特菌,在含有死菌的背景下實現對活菌的快速定量檢測。該方法克服了傳統qPCR法假陽性的缺點,能有效識別活菌(包括VBNC菌),為致病菌活菌檢測提供新的方向。

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Induction and PMA-qPCR detection ofListeriamonocytogenesin viable but non-culturable state

HUANGYun1,YUYi-gang1,HUANGXin-li2,LIXiao-feng1,XIAOXing-long1,*,WUHui1

(1.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.Huizhou Quanlity and Measuring Superrision Testing Intitute,Huizhou 516000,China)

Under the condition of 9%(w/v)NaCl,the induction of “viable but non culturable”(VBNC)Listeriamonocytogeneswas undertaken by investigating two factors,temperature and pH. In order to compare the changes of bacteria state and numbers caused by different inducing conditions,the LIVE/DEAD? BacLightTMBacterial Viability Kit was used for enumeration of total cells and viable cells. The results showed that all viableListeriamonocytogeneswere induced into the VBNC state at 2℃,pH6.0. PMA-qPCR was proposed to detect theListeriamonocytogenesexperienced different inductions. It was indicated that PMA-qPCR was an effective method to detect viableListeriamonocytogeneseven if undering the dead cells background.

VBNC;PMA;Listeriamonocytogenes;viable cells;detection

2013-07-11 *通訊聯系人

黃韻(1988-)，女，碩士，主要從事食品安全與檢測研究。

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(31101279)；國家自然科學基金面上資助項目(31271867)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金新教師類資助課題(20110172120034)；華南理工大學中央高校基本科研業務費重點項目(2013ZZ068)；惠州市科技計劃項目(0031939140712048)；廣東省科技計劃資助項目(2011B020314004)；2013年華南理工大學百步梯攀登計劃項目資助(DC30913001)。

TS207.4

：A

：1002-0306(2014)01-0137-05