桶裝脹罐番茄醬中腐敗菌分離純化及鑒定研究

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(1.石河子大學食品學院,新疆石河子 832000； 2.新疆冠農果茸集團股份有限公司技術中心，新疆庫爾勒市 841000)

桶裝脹罐番茄醬中腐敗菌分離純化及鑒定研究

楊紅紅1,陳國剛1,劉婭1,江英1，*，王陳強2

(1.石河子大學食品學院,新疆石河子 832000； 2.新疆冠農果茸集團股份有限公司技術中心，新疆庫爾勒市 841000)

從脹罐番茄醬中分離出12株菌,并對這12株菌進行傳統形態學、生理生化特性鑒定,得出在這12株菌株中有4株芽孢桿菌,3株酵母菌,3株鏈球菌,2株霉菌。經過反證實驗得出導致番茄醬脹袋的主要微生物是芽孢桿菌,酵母菌和霉菌,并通過16S rDNA序列分析及構建系統發育樹對優勢菌群芽孢桿菌鑒定為4個種,分別為:枯草芽孢桿菌,短小芽孢桿菌,凝結芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。確定了導致桶裝番茄醬脹袋的腐敗菌。

番茄醬,腐敗,分離,16S rDNA序列分析

番茄醬是鮮番茄的醬狀濃縮制品。具有番茄的特有風味,是一種富有特色的調味品,一般不直接入口。常用作魚、肉等食物的烹飪佐料,是增色、添酸、助鮮、郁香的調味佳品。番茄產業是新疆農產品加工中的支柱產業,然而近年來由于番茄醬滯銷,大包裝產品基本在露天儲存,經過不同季節及不同溫度的影響以及野蠻裝卸等因素,造成產品質量變質、脹桶漏醬、癟桶、銹蝕等現象,其中微生物引起的腐敗變質便是其中重要的問題之一,產生產品脹袋和平酸腐敗,嚴重影響了我國番茄醬的出口效益[1-2]。P.villari等研究了貯藏過程中,桶裝濃縮番茄醬中微生物的群落(包括酵母菌、乳酸桿菌和霉菌)的變化情況,及對番茄醬品質的影響[3]；B.J.O.Efiuvwewwere等分析了尼日利亞市場上銷售的三種番茄醬中的微生物構成,分離出了四種主要的微生物菌群(即桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、乳酸桿菌和明串珠菌屬)[4]。國內現有的標準中僅限于罐頭食品的商業無菌、霉菌的鏡檢計數及主要腐敗微生物的檢測(芽孢桿菌和葡萄球菌)。其中新疆進出口檢驗檢疫局對番茄醬中細菌總數、大腸菌群、厭氧菌和平酸菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌的檢測方法進行了探索和研究,建立了一套檢測番茄醬中幾種主要微生物的科學方法[5]。本文針對近年來困擾新疆番茄醬出口企業的大桶番茄醬腐敗脹罐現象,通過微生物分離、純化及分子生物學技術,從腐敗變質角度探究導致大桶番茄醬脹罐的微生物本質。本文對已經腐敗變質的番茄醬進行了微生物分離與鑒定,并通過16S rDNA 序列分析及構建系統發育樹將腐敗番茄醬中的優勢菌群芽孢桿菌鑒定為種,以期為大桶番茄醬的防腐保藏措施的實施提供理論指導。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

番茄醬 由新疆胡陽河番茄制品有限公司提供,包括正常的桶裝番茄醬、已脹袋番茄醬、疑似脹袋番茄醬Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。番茄醬加工過程中的含鹽量為2.5%～3%,酸度0.5%～1.2%(以醋酸計),經過阿氏殺菌(110～115℃)、冷卻到(35～37℃)后進行灌裝,包裝形式為無菌袋裝桶,貯藏條件在38℃以下,脹袋和疑似脹袋的番茄醬是在55℃保溫5～7d后產生了脹袋現象。Ⅰ和Ⅱ色澤醬紅,氣味和滋味正常；Ⅲ色澤醬黑粘稠,有酸腐味,開袋時有氣體排出,Ⅳ色澤醬紅偏黑,滋味有酸味,開袋時發現有少量的氣體排出,將Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三種醬置于55℃恒溫箱保溫10d,置于4℃冰箱備用,其代號分別為ⅡA、ⅢA、ⅣA,保溫后醬體顏色均變深,呈褐紅黑色,氣滋味同保溫前；正向引物27f(對應于Escherichiacoil8-27位堿基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、反向引物1495r(對應于Escherichiacoil1495-1515位堿基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′[6]上海桑尼生物科技有限公司；蛋白胨、酵母膏、瓊脂等國產生化試劑；分離純化培養基 NA培養基、LB 培養基、改良BCP培養基、PDA培養基；生化培養基 淀粉培養基、蛋白胨水培養基[7]。

AUY1200分析天平 上海精密科學儀器有限公司；DKZ-1型電熱恒溫振蕩水槽 上海精宏實驗設備有限公司；KDC-1042低速離心機 科大創新有限公司；XMTB數顯溫控儀 余姚市東方電工儀器廠；ZHJH-C1115C智能型安全超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造有限公司；OLYMPUS CHC生物顯微鏡 日本Olympus 公司；TD5A-WS臺式低速離心機 長沙湘儀離心儀器有限公司；JY04S凝膠成像儀 北京君意東方電泳設備有限公司；050-810PCR擴增儀 Tgradient 48 Biometra Tgradient。

1.2實驗方法

1.2.1 密封性檢驗 將被檢密封袋先浸入溫水中預熱,再置于86℃水浴中,讓密封袋沉入水面以下5cm,然后觀察5min,若發現有小氣泡連續上升者,表明漏氣[8]。

1.2.2 內容物增菌 樣袋洗凈、揉捏混勻、超凈工作臺紫外燈下照射30min,在無菌環境下用75%的酒精擦拭開口及周圍10cm范圍。然后用無菌小針扎幾個小孔(同時用倒置的無菌試管采集袋內氣體,在酒精燈火焰旁試燃,檢驗氣體是否是氫氣),讓袋內氣體緩慢排除,避免噴涌現象。然后用滅過菌的剪刀開口,分別取變質和正常的番茄醬內容物各25g,于225mL的生理鹽水中振蕩均勻后,再用吸管各吸取1mL菌懸液轉入10mL液體培養液中,于28、37、55℃三種溫度下連續培養4d,每隔24h記錄一次。

1.2.3 分離純化

1.2.3.1 芽孢桿菌的分離及純化 將樣品搖勻,各取1mL樣品放入滅過菌的1.5mL的EP管中,90℃沸水浴10min,然后吸取200μL以無菌涂菌棒分別涂布于營養肉湯瓊脂平板上,于37℃培養箱中培養48～72h至長出單個菌落。再根據芽孢桿菌菌落形態特征,選取菌落形態明顯不同的幾種菌落,用無菌接種環分別于NA培養基平板上劃線培養,直到長出單個菌落。再分別挑取單個菌落然后劃線到LB斜面上,活化3代后,置于4℃冰箱保存備用。

1.2.3.2 其他菌的分離純化 將樣品搖勻,然后吸取200μL以無菌涂菌棒分別涂布于改良BCP培養基、PDA培養基進行28、37、55℃三種溫度條件進行分離培養,連續培養4d,每24h觀察記錄一次[6],將培養后長出的單個菌落分別挑取少許細胞劃線到對應的培養基上,分別置28、37、55℃培養箱培養,大菌苔長出后,檢查其特征是否一致,同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物。若發現有雜菌,需要再一次進行分離純化,直到獲得純培養,接種到相應斜面培養基,于相應最適溫度培養,置于4℃冰箱保存備用保存。

1.2.4 鑒定方法 本實驗通過參考常見細菌鑒定手冊、伯杰細菌鑒定手冊[9-10]等微生物鑒定書籍采取菌落觀察、革蘭氏染色、芽孢染色并根據各菌株生理生化特性、生長特征等進行菌株的鑒定。

1.2.5 反證實驗 將分離出的菌株反接種到正常的番茄醬中,每一菌株同時接種兩批,進行平行實驗,每批12個樣袋,接種后進行密封,每隔3d進行采樣共培養15d,觀察是否有脹袋、異味和變色現象[11],取變質的番茄醬進行微生物的檢測并和正常番茄醬中分離出的微生物進行比較,確定導致番茄醬的主要致腐菌。

1.2.6 分子生物學鑒定 將純化好的菌株接種于5mL無菌MRS液體培養基中,置37℃培養18～24h,基因組DNA提取參考文獻[12]方法。PCR擴增條件：94℃預變性5min;94℃變性1min,58℃退火1min,72℃延伸2min,30個循環;72℃末端延伸10min 4℃保存。反應體系為50μL：10×E×Taq buffer 5μL,MgCl2(25mmol/L)4μL,dNTP MIX(2.5mmol/L each)4μL,引物27f(10pmol/mL)2μL,引物1495r(10pmol/μL)2μL,基因組DNA模板(100ng/μL)2μL,TaKaRa ExTaq酶(5U/μL)0.6μL,用ddH2O定容至50μL,擴增反應完畢后,取2μL的PCR產物與2μL 6×Loading buffer混合,加樣于1%瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳,如果PCR成功,則在約為1500bp處可見到清晰的條帶,純化后送上海桑尼生物技術有限公司進行序列測定。

得到的序列運用軟件拼接校準排齊后在NCBI數據庫進行BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比對,并利用軟件中的cluster W構建系統發育樹,以同源性大于99%為種的分界閾值將待測菌株鑒定到種[13],確定優勢腐敗菌。

2 結果與討論

2.1增菌前檢測及增菌結果與分析

袋裝番茄醬密封性檢測結果表明實驗所用密封袋密封性良好,放入水中并未產生氣泡,無菌試管采集袋內氣體,在酒精燈火焰旁試燃,沒有火焰產生,證明不是氫氣。

表2 桶裝番茄醬中腐敗微生物的菌落個體形態觀察

表3 桶裝番茄醬腐敗菌生理生化實驗結果

內容物出現褐變、渾濁、粘稠的現象,導致番茄醬出現這種現象的原因有化學因素和物理因素,比如番茄醬本身就有某些氧化酶使得番茄醬的顏色呈褐色而不是鮮艷的番茄本身顏色;番茄醬在貯藏過程中不同溫度和人為的野蠻裝卸對番茄醬品質都有一定影響,而微生物是導致大桶番茄醬發生質變的主要原因[14]。

2.2桶裝番茄醬腐敗微生物的分離

本實驗經分離純化得到51株菌株,在NA培養基、改良BCP培養基、PDA培養基中生長情況見表1。

表1 桶裝番茄醬腐敗微生物在不同培養基上的分離純化

由表1可知,從正常、疑似脹袋和脹袋番茄醬中總共分離出了51株菌,其中包括不產芽孢菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌,將菌落形態一樣的,并且在同一種培養基上培養的菌株篩選出來,進行革蘭氏和芽孢染色發現有同種菌株,其中芽孢桿菌為31株,不產芽孢菌為6株,霉菌、酵母菌為14株,可以看出在番茄醬中芽孢桿菌為優勢菌群。經過重復篩選后,選出12株不同的菌株進行微生物形態學和生理生化的鑒定。

2.3桶裝番茄醬腐敗微生物的鑒定

2.3.1 桶裝番茄醬腐敗微生物的形態學鑒定 從表2可以看出,9和10菌落大而厚,菌落表面光滑、濕潤、粘稠,容易挑起,菌落質地均勻,正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一,是同類菌,11和12參照霉菌鑒定手冊中霉菌的形態描述及檢索表,分別確定為：葡萄狀穗霉屬和灰綠曲霉。

2.3.2 生理生化實驗 為了進一步確定純化菌株的具體種類,進行了一部分生理生化實驗,實驗結果見表3。

由表3和表4可得出,1、2、3、4為芽孢桿菌屬,5、6、7、8為大腸埃希氏菌和棒桿菌屬；根據形態學和生理生化鑒定得出9、10菌株為季也蒙假絲酵母和季氏畢赤氏酵母。

2.3.3 反證實驗結果 將分離出的12株菌反接種到正常的番茄醬中,每3d采樣觀察,取樣之前觀察番茄醬是否有脹袋現象,取出樣品后觀察是否有異味和變色現象,如果發生變質就取0.1g番茄醬進行微生物的檢測,并與正常番茄醬中分離出的微生物進行比較,確定導致番茄醬脹袋的微生物,反證實驗結果見表4。

由表4可見,將12種菌株接種到番茄醬中,其品質有一定改變,接種后的第7d,番茄醬品質有明顯的變化,出現了不同程度的脹袋、變色和異味,第15d番茄醬的脹袋、變色和異味現象趨于穩定,將接種后發生變質的番茄醬取0.1g進行微生物檢測后,同正常番茄醬中分離出的微生物進行比較發現,接種對應菌株的數量大于正常番茄醬中該菌株的數量,由表4也可以看出1、2、3、4號主要的污染菌是芽孢桿菌,接種后異味、變色的現象都有發生,9和10號主要的產氣菌是酵母菌,而且產氣最明顯的是在3～7d中。由表4還可以看出,11、12號菌株接種到番茄醬中會引起番茄醬變色,可知霉菌會引起番茄醬色澤的變化,將脹袋中分離出的微生物與正常番茄醬中微生物進行比較,發現腐敗番茄醬中分離出的芽孢桿菌在菌群中所占比例最大,是腐敗番茄醬中的優勢菌群。

表4 桶裝番茄醬腐敗微生物反證實驗結果

注:+生長；++生長良好;0 不生長。

2.3.3 分子生物學鑒定 主要致腐菌的16rDNA序列分析及系統發育樹構建見圖1。

圖1 分離自脹袋番茄醬中芽孢桿菌的 16S rDNA系統發育樹

由圖1可以看出：Y1和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)位于同一分支,且這株菌的16S rDNA序列與Bacillussubtilis同源性均達到了99%,所以這株菌歸為Bacillussubtilis；Y2和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)在一個分支上,結合16S rDNA序列同源性結果鑒定Y2為Bacilluspumilus；Y4的16S rDNA的序列與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)AB680147的同源性達到99%,系統發育樹顯示它們與BacilluscereusAB680147在同一分支上,所以將Y4鑒定為Bacilluscereus；Y3和凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)處在同一分支,而其16S rDNA序列同源性結果達到了99%,故將其鑒定為Bacilluscoagulans,由系統進化樹可以看出短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的親緣關系較近,和凝結芽孢桿菌菌種之間親緣關系相對較遠。

3 討論

傳統的微生物鑒定方法雖然經過了很長時間的發展,已經比較完善,但是由于鑒定步驟繁多,很多反應是生物體的自然生理過程,耗時長,整個鑒定過程很緩慢;而且,很多性狀都是基于感官來判斷的,主觀的干擾很容易被引入,不能正確地反映微生態,分類不夠準確和科學。而以16S rDNA為基礎的現代分子生物學技術克服了傳統鑒定和分類方法的局限性,而且提高了解析的靈敏度,在基因水平上擴大了物種多樣性的視野,可以快速、微量、準確簡便的對微生物進行分類鑒定[15]。

以上鑒定結果可以看出,芽孢桿菌屬是腐敗番茄醬中的優勢菌群,在反證實驗當中芽孢桿菌是引起變質的主要菌群,本實驗對脹袋番茄醬中致腐微生物進行了傳統微生物鑒定和16S rDNA分子序列測序進一步確定了腐敗番茄醬中的優勢菌并將芽孢桿菌鑒定到種,構建了系統發育樹,明確了芽孢桿菌種之間的親緣關系,為大桶番茄醬的防腐措施提供了一定的理論指導。

4 結論

4.1 本實驗通過對番茄醬中腐敗微生物的分離純化得到12株菌,通過形態學鑒定和生理生化實驗確定從番茄醬中分離出的12株菌株有4株是芽孢桿菌,2株為大腸埃希氏菌和2株為棒桿菌屬,3株酵母菌,2株霉菌,其中芽孢桿菌是短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌,酵母菌是季氏畢赤氏酵母、季也蒙假絲酵母,霉菌是葡萄狀穗霉屬、灰綠曲霉。

4.2 通過反證實驗確定導致番茄醬脹袋的腐敗菌,結合傳統微生物鑒定和16S rDNA序列測定,確定腐敗番茄醬中的優勢菌群為芽孢桿菌。并進行了芽孢桿菌的系統發育樹的構建,將4株芽孢桿菌鑒定到種,通過對系統發育樹的觀察確定了短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的親緣關系較近,和凝結芽孢桿菌菌種之間親緣關系相對較遠。

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Study on isolation and identification of the spoilage microbes in bottled tomato sauce and their characteristics

YANGHong-hong1,CHENGuo-gang1,LIUYa1,JIANGYing1,*,WANGChen-qiang2

(1.College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.Xinjiang Guannong Fruit & Antler Group Co.,Ltd,korla 841000,China)

A total of 12 strains were separated from metamorphic tomato sauce. It was obtained that there were fourBacillus,three Yeast,threeStreptococcus,two Molds,in these 12 strains by the traditional morphological,physiological and biochemical characteristics. The disprove experimentally indicated that the main microorganism that leaded to bulging bag of tomato sauce wereBacillus,Yeast and Mildew,furthermore through 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree was constructed on the dominant bacteriaBacillusidentified four kinds,namely:Bacillussubtilis,Bacillupumilus,BacilluscereusandBacilluscoagulanc.Results suggested Spoilage caused the bulging bag of tomato sauce.

tomato sauce;taint;isolated;16S rDNA sequencing analysis

2013-07-01 *通訊聯系人

楊紅紅(1989-)，女，碩士研究生，研究方向:果蔬加工與貯藏。

自然基金項目(31260388);兵團科技攻關計劃(2012BA013)。

TS201.3

：B

：1002-0306(2014)01-0164-05