MBR-CANON工藝處理生活污水的快速啟動及群落變化

張肖靜，李 冬，梁瑜海，張玉龍，何永平，范 丹，張 杰

(1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.北京工業大學水質科學與水環境恢復工程北京市重點實驗室，100124北京)

近年來發展起來的厭氧工藝將越來越多的廢水有機碳源轉化為生物能源利用，導致傳統脫氮工藝硝化反硝化所需碳源不足，進而限制了脫氮效率［1］.而全程自養脫氮工藝(completely nitrogen removal over nitrite，CANON)可以利用氨氧化細菌(AOB)和厭氧氨氧化菌(anammox)的協同作用，在不消耗有機碳源的條件下實現脫氮，同時節省63%的曝氣量，被認為是最經濟有效的脫氮途徑，目前已成功應用于一些生物膜系統中［2-3］.在這些系統中，AOB處于生物膜外層消耗 DO，anammox處于缺氧內層去除氨氮和亞氮，然而生物膜法存在的堵塞等問題限制了該工藝的進一步發展.因此，關于活性污泥法CANON工藝的研究十分必要.目前活性污泥法的研究一般集中在SBR工藝［4-5］以及近幾年新興的膜曝氣反應器［6-7］.由于自養菌AOB及 anammox生長緩慢，導致CANON工藝的啟動周期長，去除負荷低，解決這些問題的關鍵是污泥的截留.MBR反應器可以將所有微生物截留在反應器內，達到較高的生物濃度，使反應器的去除負荷得到提高，同時具有較好的出水水質.有研究表明，MBR可以有效富集以游離或者聚集體形式存在的AOB和anammox等自養菌［8］，因此，若將MBR應用于CANON工藝的研究，一方面可以解決該工藝負荷低等問題，另一方面將推進MBR在污水處理領域的應用，目前關于 MBR-CANON工藝的研究未見報道，此外，CANON工藝的研究大多是基于高氨氮或者高溫廢水進行的，常溫生活污水的研究較少，為此，提出采用MBR反應器研究生活污水CANON工藝.

本實驗考察了常溫下低氨氮CANON工藝的快速啟動策略，以及該工藝應用于實際生活污水處理的可行性.同時，利用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術分析了不同運行階段反應器內的微生物群落結構特征.

1 實驗

1.1 反應器設置

采用有機玻璃圓柱形MBR反應器(圖1).反應器高20cm，內徑20cm，有效體積5.5L.內部放置聚偏氟乙烯中空纖維膜組件(廈門，鯤揚)，膜孔徑0.1 μm，有效面積0.2 m2.底部設曝氣環供氧，并設攪拌器混合泥水.整個反應器置于直徑為30 cm的水浴中，保證恒溫25℃運行.

圖1 MBR反應器裝置

1.2 接種污泥及廢水

接種污泥取自以A2/O工藝運行的北京高碑店污水處理廠的普通活性污泥(12.9 g/L，2 L).實驗前期采用人工配水(NH4+-N為80 mg/L左右，接近擬處理的生活污水質量濃度)，后期處理某大學生活區污水.配水以(NH4)2SO4和NaHCO3為主要基質，并添加 KH2PO4(0.068 g/L)、MgSO4·H2O(0.15 g/L)、CaCl2(0.068 g/L)及微量元素(1 mL/L).實驗共進行240 d，包括亞硝化的啟動、CANON工藝的啟動及穩定運行、處理生活污水3個階段.實驗期間污泥齡為100 d，反應溫度25℃，其他運行參數及各階段水質指標見表1.

表1 實驗期間水質指標及反應器運行參數

1.3 分析方法

NH4+-N:納氏試劑分光光度法;NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N:紫外分光光度法;COD:5B-3B型COD測定儀;堿度:ZDJ-2D電位滴定儀;DO、pH、T:WTW多電極測定儀.

1.4 變性梯度凝膠電泳—克隆—測序

從不同階段的反應器中取混合液離心后收集沉淀，取 1.5 g沉淀加入 10 ml磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH8.0)清洗2次.按文獻［9］方法進行總DNA提取，電泳檢驗后用試劑盒(上海生工)對DNA純化回收，以回收的DNA為模板進行PCR.采用通用引物 BSF338-GC(5’-(下劃線部分為“GC”夾)和BSR518(ATTACCGCGGCGCTGG)對全細菌16S rRNA基因V3區進行擴增［10］.反應體系組成為:DNA 1.0 μL，10 × Buffer 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μL，正義引物和反義引物(10 μmol/L)各1 μL，Ex Taq 酶(5 U/μL)0.125 μL，補水至終體積為25 μL.PCR擴增條件為:94℃，5 min;94℃，40 s，55 ℃，40 s，72 ℃，1 min，35 個循環;72℃，10 min.在 D-Code System(Bio-Rad)內利用DGGE對PCR產物進行分離，電泳條件:聚丙烯酰胺8%，變性梯度30% ～60%，緩沖液為1×TAE，電壓120 V，溫度60℃，時間5 h.之后將凝膠進行銀染［11］，將凝膠上條帶切下溶于200 μL 1×TE中，4℃放置過夜.以此為模板再次進行PCR擴增.將純化回收的PCR產物連接到載體pMD19-T(TaKaRa)上，并轉化到感受態細胞E.coli DH5α(TaKaRa)中克隆.陽性克隆送交上海生工生物公司進行測序，獲得的序列通過BLAST進行比對，并提交至Gentbank.

2 結果與討論

2.1 MBR亞硝化的啟動及穩定運行

亞氮的積累是實現CANON工藝的關鍵步驟，這需要在富集AOB的同時抑制NOB的活性.本階段控制進水氨氮為80 mg/L左右，堿度為640 mg/L左右，曝氣量為 0.3 L/min，DO為0.2 mg/L左右，采用逐漸減小HRT(8～3.5 h)的策略抑制NOB，MBR的運行情況如圖2所示.亞氮在最初2 d短暫積累后迅速降至0，所有的氨氮均被轉化為硝氮，之后隨著HRT的降低，氨氧化率逐漸下降，出水氨氮增多，然而出水亞氮仍然為0，說明NOB的活性沒有受到抑制.直至第25天當HRT降為3.5 h時，亞氮開始積累，亞氮積累率(RNA)在一周之內迅速上升至60%以上，此時，氨氮去除率為50%左右，認為成功實現了AOB的富集及亞硝化啟動.然而，隨著反應的進行，RNA難以進一步提高，說明此時NOB的活性依然沒有被完全抑制.為了進一步提高RNA，繼續降低HRT為2.4 h，亞氮積累率又迅速上升，最終達99%以上，并保持穩定運行20 d，之后進行CANON工藝的啟動.

減小HRT的本質是縮短反應時間，使NOB沒有足夠的時間消耗亞氮，最終實現亞氮的積累.同時，反應時間的減少也導致大量氨氮殘留在反應器中，形成較高的游離氨(FA)質量濃度，在第天亞氮開始積累時，反應器內氨氮濃度為50 mg/L左右，FA質量濃度為2.6 mg/L，能夠有效抑制NOB的活性.同時，反應器內DO較低，一直維持在0.2 mg/L左右，也有利于氧飽和常數較低的AOB生長.隨著AOB活性的增強及數量的增多，氨氧化率在亞氮積累后也逐漸回升，最終穩定在70%左右，這說明HRT的降低并沒有限制AOB的活性，最終出水氨氮降為20 mg/L以下.該階段的實驗結果表明，通過調節HRT在限氧條件下可以快速啟動亞硝化，該方法簡單易實施，無需改變進水水質、升溫或者外部投加藥物等.

圖2 MBR亞硝化的快速啟動

2.2 MBR-CANON工藝的啟動及穩定運行

本階段的主要目的是誘導anammox的活性，實現CANON工藝.在亞硝化啟動成功并穩定運行后，保持其他參數不變，將曝氣量由0.3 L/min降為0.2 L/min，此時反應器內DO降為0.2 mg/L，而污泥絮體形成的氧梯度可以使內部的DO降到更低，因而有利于anammox的生存.同時進一步降低HRT為1.9 h，提高進水氨氮負荷，使得單位氨氮的氧分壓減少，也有利于CANON工藝的實現［7］.由圖3可知，在降低曝氣量后反應器內逐漸出現了 TN去除的現象，第 78天RNR達0.1 kg/(m3·d)，CANON 工藝啟動成功.之后RNR逐漸升高，但升高速度緩慢，且反應器內有較多的氨氮殘留.原因是AOB活性較低，不能將所有的氨氮轉化為亞氮，因此，為了提高氨氮去除率，在第123天加大曝氣量為0.3 L/min，RNR迅速升高，最終穩定在0.70 kg/(m3·d)左右.這說明之前的供氧不足限制了CANON的活性，適當加大曝氣量有利于TN的去除.之后發現反應器中同時有氨氮與亞氮殘留，原因是anammox的活性不足，不能將氨氮和亞氮完全轉化為氮氣.有研究認為提高無機碳源質量濃度有利于提高anammox的活性［12］.因此，在進水中增加了NaHCO3的質量濃度，使無機碳源質量濃度達200 mg/L左右，pH由7.58升高到7.86，結果RNR第二次迅速上升，最終穩定在0.95 kg/(m3·d)左右.

圖3 MBR-CANON工藝的啟動及高效運行

CANON的啟動歸因于以下幾個方面:MBR中膜的截留能力可將微生物截留在反應器內，適宜SRT較長的微生物如AOB和anammox生長，避免了功能菌的流失;膜的抽吸作用使一些污泥吸附在膜絲表面，形成局部缺氧微環境，為anammox的增殖創造了適宜條件;反應器內較低的DO和較高的氨氮負荷有利于AOB和anammox的生存.本階段實驗結果說明曝氣不足會抑制CANON的脫氮效果，但較高的曝氣不利于CANON的穩定，可能造成亞氮積累或者誘導NOB的活性，因此，應維持適宜的曝氣量及DO.此外，較高的無機碳源有利于強化anammox的活性，提高總氮去除負荷.目前已報道的活性污泥法CANON工藝的啟動時間均需幾百天以上，去除負荷在 0.06 ～ 0.8 kg/(m3·d)［13］，而且大多接種的為不易獲得的厭氧氨氧化污泥.而本實驗接種普通活性污泥在78 d內成功啟動了CANON工藝，并且具有較高的總氮去除負荷(0.95 kg/(m3·d))和去除率(81%)，具有較明顯的優勢.

2.3 MBR-CANON工藝處理生活污水的運行效果

從第179天起將MBR用于處理生活污水，考慮到生活污水中存在300 mg/L左右的COD，將曝氣量增加為0.4 L/min，處理效果見圖4.引入生活污水第1天，RNR即降至0.63 kg/(m3·d).研究表明，有機物的增加將抑制anammox的活性，同時，生活污水中含有的固體懸浮顆粒(SS)及表面活性劑等物質均不利于微生物的生存.初始COD去除率為20%，之后逐漸上升，最終穩定在80%左右，這可能是由于生活污水中存在一部分異養菌，在好氧條件下其活性逐漸增強，將COD氧化，出水COD降到100 mg/L以下.反應器內COD的降低消除了其對anammox的抑制，RNR的下降速率逐漸減緩，在第192天開始回升，最終穩定在0.97 kg/(m3·d)以上.可見本實驗COD對微生物的抑制是暫時且可逆的，而且該工藝處理生活污水的TN去除比配水時略高，原因是生活污水中存在的COD使反應器內發生了一部分反硝化或者短程反硝化反應，AOB、anammox、異養菌以及反硝化菌在MBR內協同作用，共同完成了TN和COD的高效去除.

圖4 生活污水中污染物的去除效果

值得注意的是，MBR能夠有效截留SS.本階段由于天氣、人為、生活規律等影響，進水濁度波動較大，但是出水濁度均保持在1 NTU以下，達到了回用水標準.目前城市污水廠采用的傳統硝化-反硝化脫氮工藝，消耗較多的曝氣量及外加碳源，同時出水需要二沉池靜沉及進一步的深度處理.本研究采用MBR-CANON系統處理生活污水，節省63%的曝氣量，同時無需外加碳源，在單一反應器內實現了總氮和COD的同時高效去除，無需二沉池即可得到較好的出水水質，出水可直接用于校園草坪及花圃的澆灌等，為含氮廢水的處理及回用提供了新思路.

2.4 微生物群落結構特征

圖5為DGGE圖譜結果，4個樣品從左至右依次為接種污泥、反應器運行第60天、第170天及第235天的泥樣，測序及BLAST比對結果見表2.接種污泥中，β-變形菌綱(β-Proteobacteria)、γ變形菌綱(γ-Proteobacteria)、浮霉菌綱(Planctomycetia)以及酸桿菌門(Acidobacteria)的微生物為占優勢地位的菌群，此外還存在梭菌綱(Clostridia)、桿菌綱(Bacilli)、α-變形菌綱(α-Proteobacteria)的微生物．然而，以無機配水運行60 d后，條帶數由13個減少為6個，說明生物種類減少，最終在實現CANON工藝后，脫氮菌成為反應器中的優勢菌群.

圖5 不同階段的反應器內微生物DGGE結果

條帶7、12與 AOB中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)相似度高達97%和99%，在種泥與反應器運行的3個階段均存在，這說明反應器的運行條件有利于該種微生物的生存，AOB逐漸成為反應器中的優勢菌群.條帶9與AOB中的Nitrosococcus mobilis相似度高達99%，只存在于第I、II階段，說明城市污水及生活污水中有機物的存在不利于該種微生物的生存.條帶6與浮霉菌綱(Planctomycetia)中的待定斯圖加特庫氏菌(Candidatus Kuenenia)相似度高達99%，Candidatus Kuenenia是一種典型的Anammox菌屬［16］，在反應器運行的第II階段才出現，與反應器表現出自養脫氮能力的時間一致，證明反應器內氨氮的去除是由AOB和anammox菌共同作用完成的.值得注意的是，條帶13所代表的NOB中的Nitrobacter在4個樣品中均存在，這說明本實驗中NOB只是活性受到了抑制，并沒有被完全淘洗出反應器.污水處理系統中氨氧化細菌的多樣性程度越高，對復雜環境的適應能力越強，抗沖擊能力就越強，該反應器中存在兩種氨氧化菌和一種厭氧氨氧化菌，構成了較為穩定的脫氮系統.

表2 序列比對結果

3 結論

1)在曝氣量為0.3 L/min的限氧條件下，保持進水氨氮不變，通過減小HRT，在常溫MBR反應器內經32 d快速啟動亞硝化.

2)亞硝化啟動成功后，減小曝氣量為0.2 L/min，并進一步降低HRT為1.9 h，經78 d啟動CANON工藝，并通過調節曝氣量及無機碳源質量濃度，提高總氮去除負荷至0.95 kg/(m3·d).

3)將穩定運行的CANON工藝應用于生活污水的處理，可以實現COD與氨氮的同時高效去除，TN去除負荷達0.97 kg/(m3·d)以上，COD去除率達80%以上，出水濁度小于1 NTU.

4)微生物群落在反應器運行的不同階段發生了較大變化，穩定運行的MBR-CANON反應器中檢測到的氨氧化細菌為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，厭氧氨氧化菌與Candidatus Kuenenia stuttgariensis的相似度高達99%．

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