三種方法檢驗乙型肝炎血清標志物結果評價

薛芳芳　趙婷婷

[摘 要] 目的：對比酶聯免疫吸附法（ELISA）、電化學發光法（ECLIA）及時間分辨熒光分析法（TRFIA）檢驗乙型肝炎血清標志物（HBV-M）的結果，評價三種方法。方法：采集200例乙型肝炎病毒感染者及100名正常體檢者的血清，通過ELISA 法、ECLIA法、TRFIA法分別檢驗HBV-M。以ECLIA為參考，采用Kappa檢驗對不同方法學檢測結果間一致性進行評價，通過μ檢驗排除抽樣誤差可能造成的影響，通過Kappa系數大小來判定一致性強弱程度。結果：ELIAS與ECLIA比較，經μ檢驗，所有項目P均<0.05，兩種方法具有一致性；TRFIA與ECLIA比較，經μ檢驗，所有項目P均<0.05，兩種方法具有一致性。結論：三種方法檢驗乙型肝炎血清標志物結果具有高度一致性，可針對不同需要選擇合適檢測方法。

[關鍵詞] 乙型肝炎病毒；血清學標志物；酶聯免疫吸附試驗；電化學發光法；時間分辨免疫熒光法

中圖分類號：R446.11 文獻標識碼：B 文章編號：2095-5200（2014）05-073-03

乙型肝炎病毒（HBV）血清學標記物（HBV-M）[包括乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（抗HBs）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）、乙型肝炎e抗體（抗HBe）、乙型肝炎核心抗體（抗HBc）]檢查是臨床診斷、治療及判斷HBV感染者病程及傳染性的重要指標[1]。檢驗HBV-M的方法較多，包括放射免疫法、酶聯免疫吸附法（ELISA），隨著科學技術不斷發展，化學發光法（CLIA）、電化學發光法（ECLIA）、時間分辨免疫熒光法（TRFIA）在臨床實驗室逐漸得到推廣和普及[2]。為了解不同方法的檢驗效果，我們采用ELISA、ECLIA、TRFIA3種方法對HBV-M進行檢測，對比不同方法的檢驗結果，探討檢驗結果的一致性，為臨床檢驗方法選擇提供參考。

1 資料和方法

1.1 標本來源

選擇2012年9月～2013年9月門診及住院患者共200例，所有患者均經ECLIA證實為乙型肝炎病毒感染者，其中男121例，女79例，年齡7～59歲，平均年齡30.1±19.2歲，另選擇100名健康體檢患者血清，其中男46例，女54例，年齡20～43歲，平均31.2±9.6歲。

1.2 儀器和試劑

選用意大利ALISEI全自動酶標儀，北京萬泰生物工程股份有限公司生產HBV-M試劑盒；美國ABBOTT公司生產的ARCHI TECTi2000自動化免疫分析儀及配套測HBV-M全套試劑，德國Roche 公司生產的Elecsys 2010自動化免疫分析儀及配套測HBV-M全套試劑。

1.3 方法

ELISA檢測結果判定按廠家試劑說明書規定之Cut-off值作為判斷標準，夾心法檢測結果以>Cut-off值為陽性，競爭法檢測結果以

1.4 統計方法

采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，采用Kappa檢驗對三種檢測方法結果的一致性進行判斷，通過μ檢驗排除抽樣誤差可能造成的影響，以Kappa系數大小來判定一致性強弱程度，如：Kappa系數<0為差度一致性，0～0.2為微弱度一致性，0.21～0.4為弱度一致性，0.41～0.6為中度一致性，0.61～0.8為高度一致性；0.81～1.0為極強度一致性。

2 結果

3 討論

據流行病學調查顯示，全球無癥狀乙肝病毒攜帶者約2.8億，僅我國患者就有1.3億，乙肝病毒感染所致的乙型病毒性肝炎已經成為嚴重威脅人類健康的重要傳染性疾病。臨床檢驗中檢測乙型肝炎血清標志物的方法較多，按照檢測技術不同可大致分為定性檢測和定量檢測兩大類。前者包括金標法和ELISA，后者包括CLIA、ECLIA、TRFIA等[3-4]。而檢測結果的有效報告是指導臨床診斷治療的重要環節，是檢驗界結果互認的重要依據，故及其有必要對各檢驗方法結果一致性進行評價及比較[5-6]。通常定性測定主要應用于普通人群及乙肝患者進行的乙肝血清標志物檢測，常以ELISA法為主[7]。此種檢測方法操作簡單，經濟實惠，通過在檢測過程中直接進行標準量化質控，保證了檢測結果的相對有效性[8-10]。ECLIA是結合生物素及鏈霉親和素參與反應的方法，將釕作為標記物，通過測定光電信號對結果進行判定，敏感度相對增高[11-12]。既往研究認為，ECLIA相比ELISA法主要優勢在于方法簡便、自動快速、檢測結果特異性強、敏感度高，結果可定量，最重要的在于檢測時期分析敏感性為0.09ng/mL，最高濃度可達150萬IU/mL而不會出現前帶現象[13-15]。TRFIA法屬于新型熒光免疫標記技術，其以鑭系元素為標記物，相比傳統異硫氰酸熒光素所標記的熒光免疫分析，TRFIA法避免了因激發光譜和發射光譜由位移較小所指的部分重疊現象，降低了測量干擾程度。在正常情況下，其標記物銪可發出的信號極其微弱，當由外部加入某種酸性增強液后，免疫復合物中的銪就可以順利解離出，并再次形成新的螯合物，由激發光激發后便可產生非常強的熒光信號。由于TRFIA法是兩步法，儀器全自動檢測，實驗條件平穩可靠，最大程度降低了主客觀因素造成的誤差，大大降低了誤診率[16-18]。

本研究中，對比ELISA法和ECLIA法可見，兩者在HBeAg項目上表現出極強一致性，其余項目則為高度一致性。有研究認為ELISA法在判斷結果時因存在檢測灰區而影響部分結果誤讀，故對結果要求嚴格的術前檢查不宜采用此法。原因在于該法通過酶進行檢測，對反應后試劑顏色深淺用以判斷實驗結果，而抗原或抗體若同酶結合物的濃度較低時，由于反映出的吸光度值太小，故假陰性率較高，而當濃度較大時，吸光度值則變大，嚴重情況下可超出曲線敏感范圍平臺，檢驗結果準確性難以完全保證[19-21]。如本研究中在臨床最關注的HBsAg項目上ELISA法有18例漏檢，說明其敏感度的確不足。不過對于普通人群疾病篩查使用該手段較好，畢竟其費用低、操作簡單快速等優點是其他檢測方法無法比擬的。

TRFIA法檢測結果同ECLIA法在抗HBs項目上具有高度一致性，在其他項目上則具有極強一致性，同既往研究結果類似[3]。正常人檢測時出現8例HBsAg結果差異，提示兩種方法在特異度上存在區別。有研究報道，相比ELISA法，TRFIA法檢出陽性率高，可定量檢測、特異性及靈敏度均較高，在檢驗醫學中具有廣闊發展潛力[22-23]。原因在于TRFIA采用波長和時間兩種分辨技術，通過時間延長，將非特異熒光干擾清除，并于固定時間對特異熒光檢測，使自然背景干擾問題得到了解決，靈敏度極大增加；同時激發光同發射光間的Stokes移位較大，便于對兩種光波長進行分別，非特異熒光干擾得到排除，光譜分辨率明顯提高，增強了檢測結果特異度[24-26]。ECLIA法可用于對診斷明確的乙型肝炎患者治療后療效進行判斷，，TRFIA法具有檢測病毒變異的能力，在其他檢測手段難以確定時用處更大[27-28]，其通過定量結果的回歸分析，可對溯源一致的項目進行一致性程度評價，結合基因檢測手段，還可對處于病毒復制期與可能發生病毒變異的患者進行相關性分析，體現出該檢測手段的臨床價值所在。

總之，幾種HBV-M檢測手段檢測結果具有較高一致性，可針對不同需要選擇合適檢測方法。

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