FQ-PCR法檢測(cè)人骨肉瘤MG63細(xì)胞系中β-catenin基因表達(dá)

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(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科，山東 青島 266003; 2 中國(guó)人民解放軍第107醫(yī)院)

·腫瘤學(xué)研究·

FQ-PCR法檢測(cè)人骨肉瘤MG63細(xì)胞系中β-catenin基因表達(dá)

張鵬1，李書(shū)忠1，張明進(jìn)1，張豹1，曲邵政2

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科，山東 青島 266003; 2 中國(guó)人民解放軍第107醫(yī)院)

目的研究β-catenin基因在人骨肉瘤MG63細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的變化。方法培養(yǎng)人骨肉瘤MG63細(xì)胞，不同濃度Wnt3a及WIF-1蛋白刺激MG63細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)法測(cè)定細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)水平。培養(yǎng)人骨肉瘤MG63細(xì)胞，用90 μg/L的Wnt3a及WIF-1刺激細(xì)胞，分別于12、24、48、72、96 h對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察空白組、Wnt3a及WIF-1組細(xì)胞數(shù)目變化情況。結(jié)果不同濃度WIF-1組β-catenin mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=215.58，P<0.05)，隨著WIF-1濃度的增高而呈遞減趨勢(shì);不同濃度Wnt3a組β-catenin mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=185.64，P<0.05),隨著Wnt3a濃度的增高而呈遞增趨勢(shì)。空白組細(xì)胞增殖情況優(yōu)于WIF-1組，低于Wnt3a組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.88，P<0.05)。結(jié)論不同濃度Wnt3a及WIF-1刺激下β-catenin基因在人骨肉瘤MG63細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的變化，證明wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)人骨肉瘤MG63細(xì)胞有重要的調(diào)控作用。

骨肉瘤；基因，β-catenin；聚合酶鏈反應(yīng)

骨肉瘤是兒童及青少年時(shí)期常見(jiàn)的骨腫瘤之一，好發(fā)于10～20歲，約占骨惡性腫瘤的20%[1-2]。近年來(lái)，化療方案的完善及化療藥物的更新使得骨肉瘤病人的生存率有了明顯的提高[3-4]。然而，肺轉(zhuǎn)移及骨腫瘤復(fù)發(fā)仍然是骨肉瘤病人長(zhǎng)期生存的限制性因素。Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種細(xì)胞的增殖、分化中扮演重要角色。 PEIFER等[5]研究顯示，Wnt信號(hào)在骨細(xì)胞的基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。本研究通過(guò)將外源性Wnt3a 及 WIF-1作用于MG63細(xì)胞，在基因水平觀察β-catenin的表達(dá)情況，進(jìn)而探討Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨肉瘤發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料

人骨肉瘤細(xì)胞株MG63(中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所)，Wnt3a蛋白干粉、WIF-1蛋白(美國(guó)R&D公司)，PCR試劑盒(TaKara公司)，β-catenin、GAPDH引物(大連寶生物工程有限公司)，胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MG63細(xì)胞株置于DMEM高糖培養(yǎng)液(添加體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)中，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞70%融合時(shí)進(jìn)行傳代，吸除舊培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶少許，以能覆蓋瓶底為宜，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞胞質(zhì)回縮、間隙增大時(shí)加入培養(yǎng)液以終止消化。吸管吸取培養(yǎng)液，輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之呈細(xì)胞懸液。按1∶2比例進(jìn)行傳代。

1.2.2不同濃度Wnt3a、WIF-1蛋白刺激MG63細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞，傳代后接種到6孔板中的5孔中，于恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待每孔大約70%的細(xì)胞融合時(shí)，加入不同濃度的Wnt3a及WIF-1溶液刺激MG63細(xì)胞24 h。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測(cè)β-catenin基因的表達(dá) 對(duì)上述加入Wnt3a及WIF-1溶液培養(yǎng)24 h的細(xì)胞采用TRIzol法提取RNA，用紫外線分光光度計(jì)根據(jù)波長(zhǎng)260 nm處的吸光度值測(cè)定RNA的純度，并進(jìn)行定量。用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(code:DDR047S)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用PCR試劑盒(Code:DRR081A)對(duì)目的基因及內(nèi)參照進(jìn)行擴(kuò)增。β-catenin的上游引物為5′-TGAGGACAAGCCACAAGATTAC-3′，下游引物為5′-TCCACCAGAGTGAAAAGAACG-3′；GAPDH的上游引物為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游引物為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含Premix Ex TaqTMⅡ(2×)12.5 μL，10 μmol/L PCR Forward Primer和Reverse Primer各1 μL,DNA模板2 μL,dH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。按照Livak公式計(jì)算目的基因β-catenin的相對(duì)表達(dá)量,其相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT表示。

1.2.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將人骨肉瘤MG63細(xì)胞計(jì)數(shù)后等分接種于3盤30 mm×60 mm大小的培養(yǎng)基中，空白組用DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，Wnt3a組及WIF-1組分別用含90 μg/L Wnt3a、WIF-1的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)相同時(shí)間后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5Wnt3a及WIF-1蛋白刺激下細(xì)胞生長(zhǎng)情況將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞接種于48孔培養(yǎng)板，其初始細(xì)胞數(shù)約為103個(gè)，空白組、Wnt3a組及WIF-1組分別用DMEM高糖培養(yǎng)液、含90 μg/L Wnt3a及WIF-1的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。每天換液，各組分別于12、24、48、72、96 h取4孔細(xì)胞，滴入錐蟲(chóng)藍(lán)染液后在計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。按每天細(xì)胞平均數(shù)目繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1不同濃度Wnt3a及WIF-1蛋白刺激下β-catenin mRNA的表達(dá)

空白組2-△△CT均為1；30、60、90、120 μg/L WIF-1組2-△△CT分別為0.55±0.05、0.44±0.04、0.35±0.04、0.24±0.03；30、60、90、120 μg/L Wnt3a組2-△△CT分別為1.96±0.06、2.08±0.15、2.84±0.09、3.29±0.17。隨著WIF-1濃度的增高，β-catenin mRNA表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=215.58，P<0.05)；隨著Wnt3a濃度的增高，β-catenin mRNA表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=185.64，P<0.05)。

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

各組細(xì)胞均呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)均呈梭形；Wnt3a組細(xì)胞較空白組細(xì)胞排列緊密，WIF-1組細(xì)胞較空白組細(xì)胞排列稀疏。

2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

以細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。WIF-1組細(xì)胞增殖速度較空白組減慢，空白組細(xì)胞增殖速度較Wnt3a組減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.88，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 討 論

骨肉瘤是青少年及年輕人最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤之一[1-2，6]。近年來(lái)，新化療藥物雖屢屢出現(xiàn)，但轉(zhuǎn)移瘤及骨腫瘤復(fù)發(fā)仍影響病人長(zhǎng)期生存[7]。闡明骨肉瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的機(jī)制，提供針對(duì)性靶向治療是

目前最需迫切解決的問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，包括p53基因、p16基因、 FFEN基因、Survivin、CTRP3等在內(nèi)的骨肉瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及作用逐步被發(fā)現(xiàn)，使人們對(duì)骨肉瘤發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。

在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Wnts作為由半胱氨酸殘基組成的分泌型糖蛋白家族，對(duì)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮重要作用，因此，近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注[8]。Wnts信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括經(jīng)典型和非經(jīng)典型通路兩種。在經(jīng)典型通路中，活化的Wnt與膜受體Fz及LRP5、6結(jié)合激活轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)下游Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄；抑制Wnt通路時(shí)，被酪蛋白激酶-1和GSK-3β磷酸化的β-catenin泛素化而使蛋白酶破壞，進(jìn)而抑制Wnt靶基因轉(zhuǎn)錄[9]。非經(jīng)典型Wnt通路主要包括Wnt/Ca2+、Wnt/PCP等信號(hào)通路，目前具體作用機(jī)制尚不清楚。

Wnt在多種細(xì)胞的分化、增殖及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中起重要作用。KARIM等[10]結(jié)果表明，許多腫瘤的發(fā)生與Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有聯(lián)系。MATSUDA[11]和LEE[12]的研究結(jié)果顯示，Wnt信號(hào)在乳癌、肝癌的發(fā)病中起重要作用。HE等[13]也曾報(bào)道結(jié)直腸癌的發(fā)生與Wnt信號(hào)的紊亂有關(guān)。BARKER等[14]研究顯示，活化的Wnt信號(hào)通路與多種人類腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān)。CHEN等[15]研究顯示，骨肉瘤可由Wnt10b誘導(dǎo)而產(chǎn)生，且腫瘤的遷移及生長(zhǎng)與其相關(guān)。激活Wnt5a/Ror2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，骨肉瘤細(xì)胞株U2OS侵襲性增強(qiáng)；其侵襲性也可因該通路的阻斷而抑制[16]。HOANG等[17]研究顯示，LRP5作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要受體，在骨肉瘤惡化進(jìn)程中可以作為標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)歸。而CAI等[18]研究顯示，活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖；失活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路反而促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)人骨肉瘤MG63細(xì)胞，通過(guò)加入外源性Wnt3a及WIF-1蛋白來(lái)刺激經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，然后采用FQ-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)β-catenin基因表達(dá)。FQ-PCR技術(shù)具有高擴(kuò)增效率、高擴(kuò)增靈敏度、高擴(kuò)增特異性等優(yōu)點(diǎn)，并且能在寬廣的范圍內(nèi)進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量[19-20]。實(shí)驗(yàn)表明，Wnt3a激活人骨肉瘤MG63細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，強(qiáng)化Wnt信號(hào)通路下游通路β-catenin，從而增加MG63細(xì)胞數(shù)量；WIF-1刺激下β-catenin mRNA表達(dá)量均降低，隨著WIF-1濃度的增加，其表達(dá)抑制作用更明顯。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制及倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞生長(zhǎng)密集程度也同樣證實(shí)了該觀點(diǎn)。本研究提示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡中發(fā)揮了重要作用，為進(jìn)一步研究骨肉瘤基因水平的分子靶向治療提供了依據(jù)。但Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具體分子的相互作用機(jī)制尚不清楚。另外，本研究局限于體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)Wnt/β-catenin的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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(本文編輯 馬偉平)

DETECTIONOFβ-CATENINEXPRESSIONINHUMANOSTEOSARCOMAMG63CELLLINEUSINGFQ-PCR

ZHANGPeng,LIShuzhong,ZHANGMingjin,ZHANGBao,QUShaozheng

(Spine Surgery Department, The Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo study the expression of β-catenin expression in human osteosarcoma MG63 cell line.MethodsHuman MG63 cells interfered with Wnt3a and WIF-1 in different concentrations was cultured. The expression of β-catenin was detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR). Culturing human MG63 cells, interfered with the same concentration of Wnt3a and WIF-1 (90 μg/L), the cells were counted respectively at 12, 24, 48, 72 and 92 hours in each group, the cell number in the blank-observation group, Wnt3a group and WIF-1 group was observed.ResultsThe differences of β-catenin expression between different-concentration WIF-1 groups were significant (F=215.58,P<0.05), the expression tended to decrease along with the increase of WIF-1 concentration; The differences of β-catenin expression between different-concentration Wnt3a groups were significant (F=185.64,P<0.05), the expression increased by degrees along with the increase of the concentration of Wnt3a. The blank group was found to have a higher cell proliferation than WIF-1 group, and lower than Wnt3a group, the difference was significant (F=4.88,P<0.05).ConclusionThe changes of the expressions of β-catenin in MG63 cells stimulated by different concentrations of Wnt3a and WIF-1 prove that Wnt/β-catenin signal pathway play an important regulation role in human osteosarcoma MG63 cells.

osteosarcoma; genes, β-catenin; polymerase chain reaction

2013-09-03;

2013-12-06

張鵬(1988-)，男，在讀碩士研究生。

李書(shū)忠(1958-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。

R738.1

A

1008-0341(2014)03-0189-04