BRAF T1799A基因突變甲狀腺乳頭狀癌超聲特征

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(青島大學醫學院附屬醫院內分泌科，山東 青島 266003)

BRAF T1799A基因突變甲狀腺乳頭狀癌超聲特征

叢小飛，趙世華，王顏剛，王萍，劉鑫

(青島大學醫學院附屬醫院內分泌科，山東 青島 266003)

目的研究甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中BRAF T1799A突變與結節超聲特征之間的關系。方法選擇行甲狀腺切除的PTC病人160例，應用聚合酶鏈反應及DNA直接測序法檢測新鮮組織標本中BRAF T1799A基因突變情況，結合甲狀腺超聲檢查結果分析BRAF T1799A基因突變與結節邊界、鈣化、血流、淋巴結轉移及結節大小等超聲特征的關系。結果160例PTC病人中，BRAF T1799A突變陽性者46例，突變率為28.75%。BRAF T1799A突變陽性病人血流豐富的比例大于陰性者(χ2=4.88，P<0.05)；Logistic回歸分析顯示，血流豐富與BRAF T1799A突變呈正相關(OR=3.368，P<0.01)；BRAF T1799A突變陽性組與陰性組其他超聲特征比較差異無顯著性(P>0.05)。結論PTC組織中BRAF T1799A基因突變與結節血流關系密切，而與其他超聲特征無明顯相關性。

甲狀腺腫瘤；BRAF；突變；超聲檢查

近幾年來，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中的BRAF T1799A突變受到廣泛關注，現已明確該突變通過持續激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，促進腫瘤的發生和發展[1]，且與PTC甲狀腺包膜外浸潤、淋巴結轉移及腫瘤TNM分期等特征密切相關，通過多種分子機制影響甲狀腺腫瘤的生長方式。作為一種新的分子標志物，BRAF T1799A突變在PTC的輔助診斷、預后評估、指導治療等方面起著重要作用[2]。研究結果已表明，PTC中BRAF T1799A突變與血管內皮生長因子(VEGF)過量表達密切相關，且在PTC中發現了不同頻率的表皮生長因子受體(EGFR)的突變[3]，而VEGF與EGFR的過量表達通過多種途徑共同參與腫瘤血管的生成過程, 在腫瘤生長、進展與轉移中發揮重要作用[4]。以上機制很有可能通過BRAF T1799A突變而引起PTC結節生長方式的改變，因此，本研究旨在探討BRAF T1799A突變與PTC結節超聲特征的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象

選擇2011—2013年于我院行甲狀腺切除術的PTC病人160例，其中男38例，女122例；平均年齡為(45.73±13.83)歲。病人均經組織病理學檢查確診。標本采集和病例收集經過病人知情同意。癌結節按大小分為3級，<1 cm為微小癌，1～3 cm為中等大小癌，>3 cm為大結節癌；結節邊界分為清晰和欠清晰；回聲分為高、低及混合回聲；鈣化情況分為有和無鈣化；血流根據結節內部及周邊的分布情況分為豐富(3個以上點狀血流、條狀血流信號、高阻動脈血流信號)和不豐富(血流分布未見異常、1～2個點狀血流)；淋巴結轉移及腺體外浸潤分為有和無轉移或浸潤。

1.2方法

1.2.1DNA提取和PCR擴增 收集術后新鮮甲狀腺癌組織標本50 mg，按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書中的步驟提取各樣本中的基因組DNA，取基因組DNA 2 μL,用紫外線分光光度計檢測樣本吸光度(A)值，以測定所提取DNA的濃度和純度，所得合格DNA放于-20 ℃冰箱中保存備用。采用普通PCR方法對BRAF基因第15外顯子進行擴增。目的基因片段為：ATATATTTCTTCAT-GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTT-GGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGT-GGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGA-TCCATTTTGTGGATG，其上游引物序列：5′-GCT-TGCTCTGATAGGAAAATGAG-3′，下游引物序列：5′-GTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3′。

1.2.2產物測序 PTC的PCR反應產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行基因測序，分析各樣本中有無BRAF T1799A突變。

1.2.3B超資料的分析 對160例病人的B超資料,包括癌結節邊界、回聲、鈣化、血流及結節數量、淋巴結大小、結節大小及腺體外浸潤情況等超聲表現進行分析。

1.2.4統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，組間超聲特征差異比較采用卡方檢驗, BRAF T1799A與超聲表現的相關性采用Logistic回歸分析。

2 結 果

本文160例PTC標本中BRAF T1799A突變陽性者46例，陰性者114例，陽性率為28.75%(圖1、2)。BRAF T1799A突變陽性與陰性組年齡分別為(47.85±12.94)、(44.88±14.15)歲，BRAF T1799A突變陽性組男女分別為9、41例，BRAF T1799A突變陰性男女分別為29、81例，兩組年齡、性別相比較差異無統計學意義(P>0.05)。BRAF T1799A突變陽性組血流豐富的比例明顯高于陰性組(χ2=4.88，P<0.05)。見表1。Logistic回歸分析顯示，血流豐富與BRAF T1799A突變間呈正相關(OR=3.368，P<0.01)，與結節的邊界、回聲、鈣化、淋巴結轉移及腺體外浸潤等超聲特征均無相關性(P>0.05)。見表2。

圖1 BRAF第15外顯子1799位點基因分析圖譜

圖2 BRAF第15外顯子1799位點T-A基因突變分析圖譜

組別邊界清晰模糊回聲高低混合鈣化有無血流豐富否多結節是否淋巴結轉移有無腺體外浸潤有無結節大小小中大陽性133714723713272325252129113916286陰性3971710218525397156543476308034733

3 討 論

PTC是甲狀腺癌中最常見的一種類型，而BRAF T1799A突變主要發生于PTC，國內外報道的突變率為28%～83%[5-6]，本研究的突變率為28.75%，處在較低水平。BRAF基因是RET和RAS的下游蛋白激酶，是Ras/Raf/MEK/MAPK信號通路關鍵成分，其突變可持續激活MAPK信號通路，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，形成腫瘤[7]。很多研究證實，BRAF T1799A突變與高侵襲性的臨床及病理特征密切相關，如淋巴結轉移、腺體外浸潤、腫瘤分期等。XING等[8]研究認為,檢測細針穿刺樣本的BRAF T1799A突變情況可有助于甲狀腺癌的診斷，經細胞學診斷為PTC的病人應在手術前檢測其穿刺樣本的BRAF T1799A突變情況,以指導手術方式。由此可見，BRAF T1799A突變在PTC中具有獨特而重要的地位。

隨著超聲顯像成為甲狀腺腫瘤的主要診斷手段，二者的關系也受到關注。已有文獻報道，存在BRAF T1799A突變的PTC傾向于結節前后徑大于橫徑，鈣化的發生率也相對較高，但數據均無統計學差異[9]，國內外對BRAF T1799A突變與結節大小關系的結論尚不一致[10-11]。本研究結果顯示，BRAF T1799A突變與結節大小無相關性，與國內

表2 BRAF突變陽性與陰性組多因素Logistic回歸分析

報道結果一致。本研究結果顯示，BRAF T1799A突變陽性與陰性組在結節邊界、回聲、鈣化、結節大小、腺體外浸潤、淋巴結轉移等超聲表現方面比較差異均無顯著性，提示PTC中BRAF T1799A突變陽性超聲表現尚無特異性。而Logistic多元逐步回歸分析顯示， BRAF T1799A突變與血流豐富相關，其機制尚不明確。有研究結果顯示，BRAF突變與VEGF的過量表達密切相關[12]，而VEGFR信號轉導通路參與腫瘤周圍血管新生內皮細胞的遷移、增殖、生存等過程，在腫瘤周圍血管生成中發揮重要的作用。XING等[13]研究顯示，EGFR在PTC中的突變率為5%，其突變與STAT、MAPK、PI3K/AKT活性增強密切相關。PTC組織中BRAF突變率高，EGFR突變與BRAF突變很可能具一定相關性。EGFR高表達可促進血管生成和腫瘤細胞的增殖、黏附、侵襲和轉移, 抑制腫瘤細胞的凋亡[14]。因此認為，BRAF T1799A突變可能通過以上兩種機制引起結節周圍新生血管形成，使結節周圍血流信號增加，并增強了腫瘤的侵襲性。但是，具體機制還需深入探索。此外，由于沒有進行大樣本量的試驗，且本研究中甲狀腺超聲檢查對結節血流結果的報告較粗略，沒有進行分級，無具體血流阻力值，所以具有一定的局限性，未來還需要做更加細致的研究。本研究沒有發現其他超聲特征與BRAF T1799A突變有相關性，而很多研究證實BRAF T1799A突變與淋巴結轉移及病理分期呈正相關，分析其原因可能為超聲對淋巴結轉移的檢查不敏感，應結合病理報告中淋巴結轉移的結果進行分析。

綜上所述，認為PTC中BRAF T1799A突變與結節血流具有相關性，可能會對甲狀腺結節穿刺活檢起到提示作用，并通過檢測穿刺標本的BRAF T1799A突變情況，指導手術方式，評估預后。但超聲尚不能準確提示BRAF T1799A突變的存在，兩者應有效結合，以更好地指導PTC的診斷和治療。

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(本文編輯 厲建強)

ULTRASOUNDFEATURESOFBRAFT1799AGENEMUTATIONPAPILLARYTHYROIDCARCINOMA

CONGXiaofei,ZHAOShihua,WANGYan′gang,WANGPing,LIUXin

(Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the correlation between BRAF T1799A gene mutation in tissue of papillary thyroid carcinoma (PTC) and the ultrasound features of the thyroid.MethodsOne hundred and sixty patients with PTC underwent thyroidectomy were enrolled in this study. Using polymerase chain reaction (PCR) and direct DNA sequencing, the BRAF T1799A gene mutation in fresh tissue samples was detected, which was analyzed by comparing with ultrasonographic results in terms of the boundary of nodules, calcification, blood supply, lymph node metastases and tumor size.ResultsOf the 160 patients,46 were BRAF T1799A positive, mutation rate being 28.75%. Those of positive BRAF T1799A showed a higher ratio of rich blood supply of their tumor samples than the negative ones (χ2=4.88,P<0.05). Logistic regression showed a positive correlation between BRAF T1799A mutation and rich blood flow (OR=3.368,P<0.01). The chi-square test showed no significant differences between BRAF T1799A mutation positive and negative groups in other sonographic features (P>0.05).ConclusionBRAF T1799A mutation in PTC is closely associated with the blood flow around the nodules but not with other sonographic features.

thyroid neoplasms; BRAF; mutation; ultrasonography

2013-08-31;

2014-03-01

山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2013WS0266)

叢小飛(1986-)，女，在讀碩士研究生。

趙世華(1962-)， 男，主任醫師，碩士生導師。

R736.1

A

1008-0341(2014)03-0210-03