氨磷汀對(duì)荷瘤鼠放療后腫瘤保護(hù)作用

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003)

氨磷汀對(duì)荷瘤鼠放療后腫瘤保護(hù)作用

牟俊俊，安永恒

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003)

目的探討氨磷汀對(duì)C57BL/6荷瘤鼠放療后腫瘤組織的保護(hù)作用及其對(duì)放療效果的影響。方法培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞株，傳代，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至106/L，小鼠右下肢皮下注射制備荷瘤鼠模型。隨機(jī)分為放療+氨磷汀組(A組)、放療組(B組)、氨磷汀組(C組)、對(duì)照組(D組),各8只。放療前給予A組、C組荷瘤鼠腹腔注射5 mL氨磷汀溶液(8 g/L)，B組、D組給予同等劑量生理鹽水腹腔注射，30 min后A組、B組荷瘤鼠局部照射6 MV的X線10 Gy。每2 d測(cè)量小鼠體質(zhì)量及腫瘤體積；15 d后處死小鼠，TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率。結(jié)果A、B、C、D組小鼠各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量差異均無(wú)顯著意義(P>0.05)。第1天4組荷瘤鼠腫瘤體積比較差異無(wú)顯著意義(P>0.05)，第3～13天A組腫瘤體積較其他3組減小，B組腫瘤體積較C、D組減小，差異有顯著意義(F=4.290～15.470，P<0.05)；A組與B組比較、C組與D組比較，差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。A組腫瘤細(xì)胞凋亡率高于其他3組，B、C組高于D組，差異均有顯著意義(F=36.535,P<0.01)；B組、C組比較，差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。結(jié)論氨磷汀對(duì)腫瘤組織沒有明顯的保護(hù)作用，不影響放療效果；氨磷汀可能具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

氨磷汀；放射療法；免疫組織化學(xué)；細(xì)胞凋亡

放射治療是惡性腫瘤的重要治療手段，放療的副作用常常導(dǎo)致治療終止，影響病人預(yù)后。細(xì)胞保護(hù)劑能減輕放療副作用，其最理想的效應(yīng)是能夠減輕腫瘤治療中的毒性反應(yīng)和副作用，不影響腫瘤的治療效果[1-2]。大量研究結(jié)果證明，細(xì)胞保護(hù)劑氨磷

汀能夠明顯減輕放化療引起的多種組織的早期和晚期損傷，包括心臟、腸道細(xì)胞、肺組織、腺體、骨組織等[3-5]，使病人治療過(guò)程中耐受程度大大提高，從而確保了治療的完成。但是氨磷汀保護(hù)正常組織的同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞是否同樣具有保護(hù)作用，其對(duì)放療效果是否具有一定程度的削弱作用，目前仍是本專業(yè)領(lǐng)域所顧慮的問題。本文觀察氨磷汀對(duì)放療過(guò)程中的腫瘤組織是否具有保護(hù)作用，以期對(duì)臨床合理應(yīng)用此藥提供實(shí)驗(yàn)參考。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1主要材料

Lewis肺癌細(xì)胞株，購(gòu)自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室；C57BL/6小鼠32只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；氨磷汀(每支400 mg，大連美羅大藥廠生產(chǎn))，以生理鹽水稀釋至8 g/L；DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone公司)；澳洲源胎牛血清，青霉素-鏈霉素雙抗(Hyclone公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(美國(guó)羅氏公司)；美國(guó)Varian公司直線加速器(我院腫瘤放療科提供)。

1.2Lewis肺癌細(xì)胞株的培養(yǎng)及動(dòng)物模型制備

將Lewis肺癌細(xì)胞株以含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，每1～2 d換液一次。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞貼壁面積達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。調(diào)整Lewis肺癌單細(xì)胞懸液密度為106/L，每只小鼠右下肢皮下注射0.2 mL，2～3 d后可見腫瘤生長(zhǎng)[6]，成瘤率為100%，荷瘤鼠模型制備成功。飼養(yǎng)1周后荷瘤鼠即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

將荷瘤鼠隨機(jī)分為放療+氨磷汀組(A組)、放療組(B組)、氨磷汀組(C組)、對(duì)照組(D組)，每組8只。A組、C組小鼠均腹腔注射8 g/L的氨磷汀溶液5 mL，B組、D組給予等體積生理鹽水腹腔注射。30 min后，A組、B組小鼠水合氯醛全麻后固定，右下肢腫瘤區(qū)局部給予6 MV的X線源皮距照射，源皮距=100 cm，深度=3 cm，加 1 cm組織補(bǔ)償，劑量(DT)=10 Gy。

1.4觀察指標(biāo)及方法

照射后每2 d測(cè)量各組小鼠的體質(zhì)量、腫瘤最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b)，共測(cè)量7次，計(jì)算腫瘤體積(V)：V=ab2π/6。并于15 d后脫頸椎法處死荷瘤鼠，完整剝?nèi)∧[瘤組織，石蠟包埋、切片后，TUNEL法測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組荷瘤鼠體質(zhì)量比較

A、B、C、D組間各時(shí)間點(diǎn)荷瘤鼠體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.775～2.284，P>0.05)。A組、B組小鼠體質(zhì)量先減少后增加，差異有顯著性(F=2.734、5.517，P<0.05)；C組、D組小鼠體質(zhì)量逐漸增加，差異有顯著性(F=5.517、12.062，P<0.05)。見表1。

2.2各組荷瘤鼠腫瘤體積比較

第1天4組荷瘤鼠腫瘤體積差異無(wú)顯著意義(F=1.201，P>0.05)，第3～13天A組腫瘤體積較其他3組減小，B組腫瘤體積較C、D組減小，差異均有顯著性(F=4.290～15.470，P<0.05);A、B組比較，C、D組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。A組腫瘤體積第9天達(dá)到最大值，B組、C組腫瘤體積第13天達(dá)到最大值，D組腫瘤體積第5天達(dá)到最大值，差異均有顯著性(F=3.267～10.814，P<0.01)。見表2。

2.3各組腫瘤細(xì)胞凋亡率比較

A組腫瘤細(xì)胞凋亡率為0.065 7±0.010 9，B組為0.045 8±0.086 9，C組為0.043 4±0.006 0，D組為0.022 4±0.006 6。A組腫瘤細(xì)胞凋亡率高于其他3組，B、C組高于D組，差異均有顯著性(F=36.535,P<0.01)；B組、C組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。各組腫瘤細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果見圖1。

表1 各組荷瘤鼠體質(zhì)量比較

表2 各組荷瘤鼠不同時(shí)間腫瘤體積比較

A：A組，B：B組，C：C組：D：D組。TUNEL染色，400倍。

3 討 論

氨磷汀是半胱氨酸硫磷酸鹽，本身無(wú)活性，它在體內(nèi)被堿性磷酸酶水解脫磷酸轉(zhuǎn)化成有活性的代謝產(chǎn)物——含自由巰基的WR-1065，通過(guò)清除放射線所產(chǎn)生的自由基并且提供DNA損傷修復(fù)所需要的氫離子，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[7-10]。氨磷汀是目前臨床上較為公認(rèn)的細(xì)胞保護(hù)劑，一定程度上可減輕放化療毒性。

本實(shí)驗(yàn)研究氨磷汀對(duì)腫瘤細(xì)胞有無(wú)保護(hù)作用，是否會(huì)影響放射治療效果。結(jié)果顯示，A組、B組、C組與D組小鼠各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量差異無(wú)顯著性，提示在放療前30 min使用氨磷汀對(duì)腫瘤組織沒有明顯保護(hù)作用，對(duì)放射治療效果沒有明顯影響。其可能原因：①氨磷汀發(fā)揮作用依賴于堿性磷酸酶的活性，正常組織堿性磷酸酶活性較高，所以氨磷汀及其代謝產(chǎn)物在正常組織中的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腫瘤組織(約100倍)[11]；②正常組織對(duì)氨磷汀的攝取是通過(guò)濃度依賴載體介導(dǎo)的擴(kuò)散方式，而腫瘤組織依靠被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式攝取氨磷汀，后者速度遠(yuǎn)低于前者[12]；③90%的氨磷汀在6 min內(nèi)可從血漿內(nèi)清除，其半衰期極短[13]。

本文結(jié)果還顯示，第1天4組荷瘤鼠腫瘤體積比較差異無(wú)顯著性，第3～13天A組腫瘤體積較其他3組減小，B組腫瘤體積較C、D組減小，差異有顯著性，提示放療對(duì)腫瘤的增殖有一定的抑制作用，氨磷汀對(duì)腫瘤組織無(wú)保護(hù)作用。本文A組腫瘤細(xì)胞凋亡率高于其他3組，B、C組高于D組，差異均有顯著性；B組、C組比較，差異無(wú)顯著性。提示氨磷汀可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。其機(jī)制可能為與p53基因誘導(dǎo)凋亡具有協(xié)同作用，也可能通過(guò)p53途徑實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，腫瘤放射治療前應(yīng)用氨磷汀可減輕放射治療相關(guān)副作用，其在保護(hù)正常組織細(xì)胞的同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞沒有明顯的保護(hù)作用；并且氨磷汀能夠一定程度促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高放射治療效果。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

THEPROTECTIVEEFFECTOFAMIFOSTINEONTUMORINCANCER-BEARINGMICEAFTERRADIOTHERAPY

MOUJunjun,ANYongheng

(Oncology Department, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the protection effect of Amifostine (AMI) on tumor tissues in cancer-bearing mice after radiotherapy (RT) and its influence on efficacy of the therapy.MethodsA cultivation and passage of Lewis lung cancer lines were carried out, and single-cell suspension made, the cell density was then modulated to 106/L and subcutaneously injected to right lower limb to create a cancer-bearing model in mice. The mice were randomized to four groups as group A (AMI+RT), group B (RT), group C (AMI), and control group, with eight mice in each group. Before radiotherapy, an intraperitoneal injection of 5 mL (8 g/L) AMI was offered to the mice in group A and group C, a same dose of normal saline was given to those in group B and control group, 30 minutes later, the mice in groups A and B received local irradiation (6 MV-X, 10 Gy). The body weight and gross tumor volume were measured every two days. Fifteen days later, the mice were sacrificed for detecting apoptosis of tumor cells using TUNEL method.ResultsThe differences of body weight between the mice in the four were not significant (P>0.05). On the first day, tumor volume in the mice between the four groups were not significantly different (P>0.05), on days 3 to 13, the tumor volume in the mice of group A was decreased versus the other three groups, and that in group B was smaller than that in groups C and D, the differences being significant (F=4.290-15.470,P<0.05), and the difference between groups A and B, as well as C and D, no significant differences were noted (P>0.05). The cell apoptosis in group A was higher than that in the other three groups, and that in groups B and C was higher than that in group D, the differences were significant (F=36.535,P<0.01), and the difference of that between groups B and C was not significant (P>0.05).ConclusionAmifostine does not protect tumor tissues and affect the efficacy of radiotherapy. It’s likely that Amifostine has an action to promote apoptosis of tumor cells.

amifostine; radiotherapy; immunohistochemistry; apoptosis

2013-10-26;

2014-03-26

牟俊俊(1986-)，女，在讀碩士研究生。

安永恒(1961-)，男，碩士，主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師。

R734.2

A

1008-0341(2014)03-0213-03