冠心病猝死者心肌細胞CARP和CaMKⅡ的表達

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(青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011； 1 病理科; 2 心內科)

冠心病猝死者心肌細胞CARP和CaMKⅡ的表達

崔啟春1，楊彥華1，于建憲1，張七一2，丁華民2

(青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011； 1 病理科; 2 心內科)

目的了解冠心病猝死(SCD)者心肌組織中心錨重復蛋白(CARP)及鈣離子依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表達,并探討其法醫(yī)學意義。方法收集30例SCD尸檢心肌組織為實驗組，30例非SCD尸檢心肌組織為對照組，應用免疫組織化學方法檢測兩組標本中CARP和CAMKⅡ的表達。結果實驗組CARP和CaMKⅡ表達明顯高于對照組,差異有顯著性(Z=-6.706、-7.018，P<0.01)。實驗組中CARP表達與CaMKⅡ表達呈正相關(r=0.833，P<0.01)。結論SCD者心肌細胞中CARP和CaMKⅡ的表達升高可能與SCD的發(fā)病相關，可以為法醫(yī)鑒定SCD提供重要證據。

法醫(yī)學；猝死，心臟；免疫組織化學；心錨重復蛋白；鈣離子依賴性蛋白激酶Ⅱ

世界衛(wèi)生組織將心源性猝死定義為各種心臟原因所致的突然死亡，病人在原有心臟疾病基礎上發(fā)生急驟的變化后24 h內死亡，壞死心肌組織于發(fā)病6 h后發(fā)生明顯改變[1]。心源性猝死者既往可伴有心臟疾病但是死亡的時間和模式是不可預測的[2]。美國冠心病猝死(SCD)發(fā)病率為(100～200)/10萬，每年有33.5萬～35.0萬人死于SCD，我國每年心源性猝死人數達120萬，其中80%為SCD[3]。對于SCD發(fā)病機制的深入研究和尋找有效的檢查方法是人們迫切需要解決的問題。相關研究結果顯示，心錨重復蛋白(CARP)和鈣離子依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)通過激活血管生成遞質或作為病理信號傳導通路中的一員參與心肌損傷修復過程。直接應用人體標本檢測并研究兩者共同表達及相關性鮮有報道[4]。本研究應用免疫組化方法，檢測CARP和CaMKⅡ在SCD者心肌組織中的表達，并探討其在法醫(yī)病理學中的應用及意義。

1 材料和方法

1.1標本及其來源

查詢2011—2013年我院病理科尸檢記錄，結合臨床及病理學資料選取診斷為SCD者的尸檢心肌組織蠟塊標本共30例作為實驗組，男17例，女13例；年齡38～76歲，平均48.2歲；均于發(fā)病后24 h內死亡，其中6 h內死亡5例，12 h內死亡18例，全部病例均在死后48 h內經全面系統(tǒng)尸檢證實其冠狀動脈主要分支中至少一支病變程度達Ⅲ級或Ⅳ級，且能排除其他可能導致猝死疾病。同時，選取非SCD尸檢心肌組織蠟塊標本30例作為對照組，其中肺動脈栓塞所致猝死者6例，病毒性心肌炎所致猝死者3例，擴張型心肌病所致猝死者2例，失血性休克、機械性窒息、交通事故、腦挫裂傷等非心源性猝死者19例；男21例，女9例；年齡18～77歲，平

均40.8歲。對照組所有病例尸檢均證實無冠狀動脈病變或僅有Ⅰ級輕度病變。

1.2主要試劑

兔抗人CARP多克隆抗體(bs-8074R，濃縮型)和兔抗人CaMKⅡ多克隆抗體(bs-9921R，濃縮型)，北京博奧森生物技術有限公司生產；即用型快速免疫組化MaxVision檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術開發(fā)公司。

1.3實驗方法

1.3.1組織形態(tài)學觀察 按常規(guī)方法進行蘇木精-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察兩組標本組織形態(tài)學特征。

1.3.2CARP和CaMKⅡ表達檢測 采用免疫組織化學染色法，應用即用型快速免疫組化Max Vision檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒進行檢測，按試劑盒說明書操作。CARP需用0.01 mmol/L、pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液進行高壓修復，CaMKⅡ需用pH 9.0的EDTA抗原修復液進行修復。CARP和CaMKⅡ抗體稀釋度為1∶100。CARP和CaMKⅡ均用已知的乳癌切片作為陽性對照，用與一抗同種兔的非免疫血清代替一抗作為陰性對照。

1.4免疫組化結果判斷

CARP陽性染色定位于胞漿內，著色程度深淺不一，呈片狀、灶狀或彌漫分布，細胞核有少量表達。CaMKⅡ陽性染色為胞漿內大部分區(qū)域呈現彌漫性棕黃色顆粒。參照文獻[5]標準，將染色深淺與背景著色相對比后，先進行染色強度計分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再進行陽性細胞所占百分比計分：陰性細胞0分，陽性細胞≤25%計為1分，陽性細胞26%～50%計為2分，陽性細胞51%～75%計為3分，陽性細胞>75%計為4分。根據染色強度計分與陽性百分比計分之和判定結果：0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為()，6～7分為()，其中()判為弱陽性，()判為陽性。大片出血壞死區(qū)域、受擠壓組織及切片邊緣不計入陽性成分判斷。

1.5統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0軟件進行數據處理，數據間比較采用秩和檢驗，相關性采用Spearman相關分析。

2 結 果

2.1兩組標本HE染色結果比較

實驗組部分病例心肌組織鏡下可見大面積心肌組織纖維斷裂，組織間質水腫，另有部分心肌細胞出現空泡變性，肌原纖維及細胞核溶解消失；部分心肌梗死區(qū)域表現為凝固性壞死，心肌細胞胞漿嗜伊紅性增高，核消失；梗死灶邊緣可見充血帶及中性粒細胞浸潤，心肌細胞腫脹，胞漿內出現顆粒狀物及不規(guī)則橫帶；冠狀動脈左前降支、左旋支、右冠狀動脈管腔狹窄，程度均>50%,部分管腔畸形、內膜增厚，纖維結締組織增多，其中5例可見管腔內血栓形成，血栓內見大量無定形壞死物、膽固醇結晶及少量泡沫細胞。對照組中有3例見散在心肌組織纖維部分區(qū)域斷裂，心肌組織細胞輕度水腫，點狀嗜伊紅增強；冠狀動脈左前降支、左旋支、右冠狀動脈管腔無病變或略狹窄，程度均<25%。

2.2兩組CARP和CaMKⅡ表達比較

實驗組中有23例胞漿內出現棕黃色CARP陽性表達；對照組僅有4例心肌組織胞漿內見CARP弱陽性表達,其余均為陰性。實驗組中有25例胞漿內出現棕黃色CaMKⅡ陽性表達；對照組僅有3例胞漿內見CaMKⅡ弱陽性表達，余為陰性。實驗組與對照組CARP與CaMKⅡ表達比較，差異有顯著性(Z=-6.706、-7.018，P<0.01)。見表1。

表1 兩組CARP及CaMKⅡ表達比較(n=30,例)

2.3SCD心肌組織CARP與CaMKⅡ表達相關性

SCD心肌組織中CARP與CaMKⅡ表達呈正相關(r=0.833，P<0.01)。

3 討 論

法醫(yī)檢案工作中常會遇到猝死案例，其中又以SCD最為常見，在SCD心肌中找到一種能在法醫(yī)實際檢案中具有一定特異性及穩(wěn)定性的形態(tài)學指標將為法醫(yī)病理學工作者提供極大的幫助。

CARP是一種主要在心臟表達的核蛋白，在血管新生內皮細胞、上皮細胞、乳癌細胞中均有少量表達[6]。CARP在心臟發(fā)育過程中及心血管細胞受損、缺血性心肌病中表達均上調。影響CARP表達的主要因素有：各種可以導致氧化應激的因素(阿霉素、低氧血癥、缺血再灌注等)、β-腎上腺素受體激動劑、蛋白激酶A及CaMK、心肌組織損傷、血管緊張素Ⅱ、白細胞介素-1、單核細胞趨化因子等[7-8]。以往研究證實，CARP具有誘導血管新生、調節(jié)細胞凋亡以及參與心肌結構和功能的調節(jié)[9]。本文HE染色結果顯示，實驗組標本冠狀動脈血管內膜損傷較對照組嚴重，部分病例有冠狀動脈血栓形成，心肌組織缺血低氧及再灌注損傷均較為嚴重；免疫組化研究結果表明，實驗組心肌組織中CARP的表達較對照組顯著升高，提示CARP可能作為已知血管生成因素中有關信號轉導途徑中的一員，成為新血管生成內在機制的組成部分，其可能對血管生成激活物的抑制劑有阻遏作用，或者激活一類血管生成遞質，例如VEGF、FIK-1或Ang-Ⅰ等。近來研究顯示，CARP 表達不僅定位于細胞核中，在心肌細胞、肌小節(jié)Ⅰ區(qū)中也有表達，在肌小節(jié)Ⅰ區(qū)CARP 與肌小節(jié)蛋白特定的氨基端結合為肌靶蛋白[10]，肌靶蛋白氨基端在心肌細胞中表達過度導致肌小節(jié)結構被破壞，因此，肌靶蛋白與CARP 的相互作用需要保持肌小節(jié)的完整性[10]。本文實驗結果顯示，CARP陽性表達部位位于胞漿中，且肌小節(jié)斷裂處及細胞連接處表達量明顯增多。推測在心肌損壞的肌纖維中CARP 可能被誘導表達過度。CARP在細胞中分布和表達的異常導致其成為組織修復研究的新靶點。

對于SCD的認識，有觀點認為Ca2+和CaMKⅡ的激活導致心肌細胞功能紊亂及細胞膜電生理不穩(wěn)定，CaMKⅡ的激活伴隨著細胞內Ca2+增多及氧化，被激活的CaMKⅡ參與組成病變的信號傳導通路，催化磷酸化一系列對細胞ECC和細胞生存至關重要的靶蛋白，包括離子通道中Ca2+平衡蛋白、轉錄因子和導致心肌肥厚和炎癥的基因表達，這些豐富多樣的靶蛋白可以幫助解釋CaMKⅡ對心肌細胞機械及電生理功能潛在的影響。CaMKⅡ的激活被認為是導致心力衰竭、心律失常及心源性猝死眾多病理信號傳導通路中的關鍵部分。本文結果顯示，CaMKⅡ在受損細胞胞漿中表達為陽性，考慮為心肌細胞缺血再灌注損傷引起Ca2+外流導致CaMKⅡ被激活；與對照組比較，實驗組損傷心肌細胞中CaMKⅡ高表達。再次證實CaMKⅡ的激活可能引發(fā)心肌細胞電生理紊亂，CaMKⅡ表達及活性增加導致心肌梗死后心力衰竭及SCD的發(fā)生[11]。因此，可以推測CaMKⅡ在心肌中被激活是導致冠心病心肌梗死后猝死過程中的重要環(huán)節(jié)。

本研究應用免疫組織化學法觀察人體心肌組織CARP和CaMKⅡ的表達，結果顯示，實驗組心肌細胞中23例CARP表達陽性，對照組僅有4例CARP表達為弱陽性(其中1例為病毒性心肌炎猝死，1例為擴張型心肌病猝死，2例為機械性窒息猝死)；實驗組心肌細胞胞漿中25例CaMKⅡ表達為陽性，對照組有3例表達為弱陽性(其中2例為肺栓塞猝死，1例為擴張型心肌病猝死)，兩組CARP和CaMKⅡ表達差異有顯著性，且二者呈明顯正相關。對于本研究中實驗組部分病例出現CARP和CaMKⅡ陰性表達及對照組部分病例出現弱陽性表達，原因可能與取材定位不準確，標本固定不及時造成自溶、抗原丟失以及背景著色干擾判斷等因素有關。本文研究結果提示，CARP和CaMKⅡ表達的增高與SCD的發(fā)生有一定的相關性，二者在SCD發(fā)病的病理生理過程中發(fā)揮了一定的作用。本研究缺少實驗組內CARP、CaMKⅡ陽性表達強度與死亡時間及病變程度的相關性分析，以后工作中我們將收集更多SCD標本，完善相關數據，對研究結果做出更加全面系統(tǒng)的分析。

綜上所述，應用免疫組化法觀察猝死者心肌組織CARP和CaMKⅡ表達情況，可以為法醫(yī)病理工作者鑒別診斷SCD提供幫助，具有一定的實際意義。此外，聯合檢測CARP和CaMKⅡ在SCD高危人群血液中的表達情況，可能為SCD高危人群干預及治療提供幫助。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

EXPRESSIONSOFCARDIACANKYRINREPEATPROTEINANDCALCIUMDEPENDENTPROTEINKINASEⅡINPATIENTSSUDDENDEATHOFCORONARYHEARTDISEASES

CUIQichun,YANGYanhua,YUJianxian,ZHANGQiyi,DINGHuamin

(Department of Pathology, The Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266011, China)

ObjectiveTo understand the expressions of cardiac ankyrin repeat protein (CARP) and calcium dependent protein kinase Ⅱ (CaMKⅡ) in myocardial tissue of patients sudden death of coronary heart diseases (CHD), and explore its signi-ficance in forensic medicine.MethodsMyocardial tissues collected from autopsy in 30 cases of sudden cardiac death (SCD) served as experimental group, and 30 of non-SCD served as control group, the expressions of CARP and CaMKⅡ in samples of the two groups were detected by immunohistochemistry.ResultsThe expressions of CARP and CaMKⅡ in myocardium of the experimental group were higher than that of the control (Z=-6.706,-7.018;P<0.01), and the expressions between CARP and CaMKⅡ were positively correlated (r=0.833,P<0.01).ConclusionThe elevation of expressions of CARP and CaMKⅡ in SCD patients’ heart muscle cells is likely to associate with the development of the condition, which may provide an important evidence for medicolegal expertise.

forensic medicine; sudden death, cardiac; immunohistchemistry; cardiac ankyrin repeat protein; calcium dependent protein kinase Ⅱ

2013-10-13;

2014-03-31

青島市科技發(fā)展計劃立項項目(13-1-4-129-jch)

崔啟春(1984-)，男，在讀碩士研究生。

于建憲(1954-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師。

R892.1

A

1008-0341(2014)03-0225-04