血管緊張素Ⅱ對成骨細胞IL-6表達的影響*

徐良志，張 晨

1)核工業四一七醫院骨科 臨潼 710600 2)西安交通大學醫學院第二附屬醫院骨一科 西安 710004

近年研究[1]發現，骨組織存在局部的腎素-血管緊張素系統，而且對骨骼的生長、發育及代謝發揮著重要的調控作用。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統的主要效應肽，具有重要的生理功能。骨組織局部腎素-血管緊張素系統對骨代謝的調節主要表現在AngⅡ促進成骨細胞分泌細胞因子，進而促進破骨細胞的形成和活化，其中破骨細胞分化因子(RANKL)便是其中之一[2-3]。白細胞介素-6(IL-6)同樣可以促進破骨細胞的形成和活化，在骨代謝中發揮重要作用[4]。但是AngⅡ是否能促進成骨細胞IL-6的表達以及作用機制還不明確。以前的研究[5]表明，細胞內活性氧和NF-κB信號通路在調節IL-6的表達中發揮了非常重要的作用。而在其他研究[6-7]中發現AngⅡ可以增加細胞內活性氧以及激活NF-κB信號通路。為此，作者利用小鼠成骨樣細胞株MC3T3-E1來研究AngⅡ是否能促進成骨細胞表達IL-6以及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠成骨樣細胞株MC3T3-E1購自上海生命科學研究院細胞資源中心，α-MEM培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗、Trizol試劑盒均購自美國Gibco公司，AngⅡ、奧美沙坦(olmsartan，Olm)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyleysteine，NAC)，2'，7'-二氯熒光黃二乙酸酯(DCFH-DA)、吡咯烷二硫代甲酸銨鹽(PDTC)均購自美國Sigma公司，兔抗小鼠NF-κB p65抗體和磷酸化p65(p-p65)抗體均購自美國Abcam公司，HRP標記羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司，逆轉錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司，IL-6 ELISA試劑盒購自美國R＆D公司，PCR擴增儀購自美國Bio-Rad公司，RIPA裂解液購自美國Thermo Scientific公司，增強型ECL化學發光檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預染蛋白質分子量標準購自碧云天生物技術研究所，垂直板電泳儀購自北京六一廠，轉移電泳槽購自美國伯樂公司，熒光顯微鏡數碼照相系統購自日本Nikon公司。

1.2 細胞培養及分組 先將MC3T3-E1細胞復蘇，用含體積分數10%胎牛血清的α-MEM培養基37℃、體積分數5%CO2飽和濕度培養。每2 d更換一次培養液，待細胞長滿后傳代。取對數生長期的細胞進行以下實驗。用無血清培養基培養12 h后，調整細胞密度為5×106mL－1，然后分為5組:對照組(用無血清培養基培養)、AngⅡ處理組[給予AngⅡ處理24 h(預實驗結果顯示AngⅡ對成骨細胞IL-6 mRNA的促進作用隨著其濃度的增加而增加，故選用10－6mol/L AngⅡ對細胞進行干預)]、AngⅡⅠ型受體阻滯劑Olm+AngⅡ處理組(10－5mol/L Olm預孵育1 h，再給予10－6mol/L AngⅡ處理24 h)、氧自由基清除劑 NAC+AngⅡ處理組(10－3mol/L NAC預孵育1 h，再給予10－6mol/L AngⅡ處理24 h)、NF-κB信號通路阻滯劑PDTC+AngⅡ處理組(10－4mol/L PDTC 預孵育 1 h，再給予 10－6mol/L AngⅡ處理24 h)。每組均設5個平行對照。

1.3 各組細胞中IL-6 mRNA的RT-PCR檢測細胞給予不同干預(實驗分組同1.2)后，用Trizol試劑盒提取細胞內總RNA，然后反轉錄成cDNA。用PCR Mix試劑和PCR擴增儀按照說明書步驟及要求進行擴增后，取擴增產物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統進行分析，以目的基因條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示mRNA的相對表達量。IL-6上游引物序列5'-ACAAAGCCA GAGTCCTTCAGAG-3'，下游引物序列 5'-CCTTAGC CACTCCTTCTGTGACT-3'，擴增產物大小為378 bp;GAPDH上游引物序列5'-ACCACAGTCCATGCCAT CAC-3'，下游引物序列5'-TCCACCACCCTGTTGCTG TA-3'，擴增產物大小為486 bp。

1.4 各組細胞上清液中IL-6含量的ELISA測定細胞給予不同干預(實驗分組同1.2)后，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。在450 nm的波長下測定樣本的吸光度值，然后根據標準曲線計算細胞上清液中IL-6的含量(ng/L)。

1.5 各組細胞內活性氧的測定 細胞給予不同干預(實驗分組同1.2)后，去除細胞培養液，加入稀釋好的DCFH-DA(用無血清培養液稀釋至終濃度為10－5mol/L)，加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，在細胞培養箱內培養30 min，用無血清培養液洗滌細胞3次，然后在熒光顯微鏡下采集圖像信息，每組采集2個視野，最后利用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件進行熒光值分析。

1.6 各組細胞中 p65和 p-p65表達的 Western blot檢測 用細胞裂解液提取各組細胞內總蛋白，然后加入上樣緩沖液，煮沸，10 min變性。上樣量為15 μL/孔，然后進行凝膠電泳、轉膜。轉膜后，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后加入兔抗小鼠p65和p-p65單克隆抗體4℃過夜。然后加入HRP標記的山羊抗兔二抗室溫孵育2 h。最后在暗室中加ECL顯影，選β-actin作為內參對目的蛋白進行對比分析。采用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件進行圖像的灰度定量分析。

1.7 各組細胞中p65核內移的免疫熒光檢測 為了進一步驗證NF-κB信號通路的被激活情況，利用細胞免疫熒光技術，觀察p65蛋白的核內移情況。調整細胞密度為5×106mL－1，然后按實驗目的給予各組細胞不同干預(實驗分組同1.2)。40 g/L中性多聚甲醛固定，用2.5 g/L的 Triton X-100透膜，BSA封閉，然后加入兔抗小鼠p65一抗4℃過夜，熒光二抗在37℃下孵育2 h，DAPI染核3 min，最后在熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組細胞中IL-6 mRNA和蛋白、活性氧、p65和p-p65表達的差異，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 各組細胞中IL-6 mRNA和蛋白的表達 見表1。

2.2 各組細胞內活性氧的測定結果 見圖1、表2。

表1 各組細胞中IL-6 mRNA和蛋白的表達

圖1 各組細胞內活性氧的測定結果(×400)

表2 各組細胞內活性氧、p65和p-p65表達的比較

2.3 各組細胞中p65和p-p65表達的結果 見圖2、表2。免疫熒光檢測結果表明，AngⅡ可以明顯增加p65蛋白在細胞核內的表達，這種現象可以被Olm、NAC以及PDTC所抑制(圖3)。

圖2 各組細胞中p65和p-p65的表達

圖3 各組細胞中p65的細胞內定位(×400)

3 討論

細胞因子與骨吸收密切相關，并且參與一些疾病的發病過程，如骨質疏松、類風濕性關節炎等[8]。許多細胞因子是由成骨細胞分泌的，可以調節破骨細胞的分化、成熟以及成熟破骨細胞的激活[9]。而IL-6就是由成骨細胞分泌的、可以調節破骨細胞的分化、成熟以及成熟破骨細胞激活的細胞因子，它在骨代謝中發揮重要作用[4，10]。以前的研究[11]表明許多骨吸收因子如TNF-α、IL-1以及甲狀旁腺激素都可以促進成骨細胞分泌IL-6。

AngⅡ是腎素-血管緊張素系統的主要效應肽[12-13]，它可以調節許多組織的生長、發育、凋亡以及炎癥反應[14-16]。研究[5]發現 AngⅡ可以促進血管平滑肌細胞以及單核細胞分泌IL-6和MCP-1，并且AngⅡⅠ型受體阻滯劑可以明顯降低慢性心力衰竭患者血清IL-6水平[17]，表明IL-6很可能是AngⅡ發揮生理效應的中間介質。

該研究發現，AngⅡ可以明顯促進成骨細胞IL-6的表達，但這種作用可以被其Ⅰ型受體阻滯劑Olm所阻斷，同樣，氧自由基清除劑NAC以及NF-κB信號通路阻滯劑PDTC可以阻斷AngⅡ對成骨細胞IL-6表達的促進作用;AngⅡ可以明顯增加成骨細胞內活性氧以及p65的磷酸化水平，并且還可以增加p65蛋白從胞漿到胞核的移動。這些實驗結果充分說明了AngⅡⅠ型受體/活性氧/NF-κB信號通路在AngⅡ促進成骨細胞表達IL-6的過程中發揮重要作用。

AngⅡ主要通過Ⅰ型和Ⅱ型受體發揮作用[18]，而作者的研究發現AngⅡ促進成骨細胞IL-6的表達主要通過Ⅰ型受體起作用。研究[6-7]表明，AngⅡ可以促進心肌細胞、腎小球內皮細胞內活性氧的產生，進而促進一些炎癥因子的表達。該研究同樣發現活性氧在AngⅡ促進成骨細胞表達IL-6的過程中發揮重要作用。而且，AngⅡ促進細胞內活性氧產生的作用可以被AngⅡⅠ型受體阻斷劑以及以自由基清除劑所阻斷，而NF-κB信號通路抑制劑對此卻沒有作用。NF-κB信號通路抑制劑可阻斷AngⅡ對成骨細胞IL-6表達的促進作用。而AngⅡ同樣可以增加p65的磷酸化水平，這種作用也可以被AngⅡⅠ型受體阻斷劑、自由基清除劑和NF-κB信號通路抑制劑所阻斷。

綜上所述，AngⅡ首先通過AngⅡⅠ型受體促進成骨細胞內活性氧的產生，進而作用于NF-κB信號通路，最后促進成骨細胞高表達IL-6。

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