發熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核蛋白的原核表達與鑒定*

胡小寧，黃學勇，杜燕華，尤愛國，許汴利#

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001 2)河南省疾病預防控制中心傳染病防治所 鄭州 450016

發熱伴血小板減少綜合征是近年來發生在我國河南、湖北、山東等地區的一種新發傳染病，2010年河南信陽報道“蜱咬人致死”事件后，該病備受各界關注。研究[1-2]證實發熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)是引起該綜合征的病原體。SFTSV屬于布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬，與其他布尼亞病毒科病毒相類似，其基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個單股負鏈RNA組成;其中S片段屬于雙義RNA，分別編碼核蛋白(nucleocapsid protein，NP)和非結構蛋白[3-4]。在布尼亞病毒感染的臨床病例中，病毒NP是主要的免疫原，患者體內相應的抗體水平較高[5-6]。目前以部分布尼亞病毒科病毒NP作為目標抗原的檢測試劑已廣泛應用于實驗室檢測，如裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV) 等[5，7]。該研究擬構建SFTSV NP的原核表達載體并表達、純化，獲取具有抗原性的重組NP;以純化的NP作為診斷抗原，建立檢測血清樣本中NP抗體的ELISA檢測方法，為后續血清學檢測試劑的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、毒株和標本 菌株E.coli JM109和克隆載體pMD18-T購自大連寶生物工程有限公司，原核表達載體pMAL-c2x、SFTSV毒株SH105均由鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室保存。體檢健康人血清(48份)和信陽SFTSV流行區臨床診斷為SFTSV感染者急性期血清(96份)標本由該教研室保存。

1.2 主要試劑和儀器 RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，SFTSV RNA檢測試劑盒(RT-PCR熒光探針法)購自北京華大吉比愛生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，限制性內切酶XbaⅠ、HindⅢ以及其他酶類均購自大連寶生物工程有限公司，膠回收試劑盒購自杭州艾斯進公司，質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，IPTG、X-Gal、NC 膜、鼠抗人 IgG、HRP 標記羊抗人IgM以及TMB底物、顯色試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、蛋白半干轉膜儀、酶標儀均購自BIO-RAD公司，Amylose樹脂預裝柱、蛋白純化儀均購自GE公司，其他試劑為國產分析純。

1.3 引物設計 參照 BX-2010/Henan/CHN strain河南分離株HQ642768.1基因組序列，利用Primer 5.0設計針對NP基因的PCR上游引物序列(NK1-1:5'-GCTCTAGAATGTCAGAGTGGTCCAGAAT-3')和下游引物序列(NK1-2:5'-CGCAAGCTTTTACAGGT TCCTGTAAGCAG-3')，分別在上、下游引物序列引入XbaⅠ和HindⅢ酶切位點，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 NP基因PCR擴增 取SFTSV細胞培養物140 μL提取病毒RNA，逆轉錄為cDNA后通過PCR擴增NP基因。50 μL的反應體系中加入Extaq 25 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 1 μL，最后加不含RNase ddH2O至終體積。擴增條件:95℃預變性3 min;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環;72℃延伸10 min。擴增產物以15 g/L瓊脂糖電泳鑒定。

1.5 NP原核表達載體的構建和鑒定 PCR產物回收后與pMD18-T載體連接并轉化至JM109感受態細胞中，轉化產物均勻涂抹于LB固體培養基(氨芐青霉素 100 mg/L，IPTG 24 mg/L，X-Gal 40 mg/L)，于37℃條件下培養過夜。挑選陽性單克隆菌落培養后提取質粒，酶切鑒定并送至南京金斯瑞科技有限公司進行測序。分別將測序正確的重組質粒和表達載體pMAL-c2x經XbaⅠ、HindⅢ雙酶切后回收目的片段，回收產物連接、轉化至JM109感受態細胞中。菌液提取質粒后酶切鑒定。

1.6 目的蛋白的誘導表達 取酶切鑒定正確的菌液按1∶100體積比接種于LB液體培養基(氨芐青霉素100 mg/L)，37℃振蕩培養至OD≈0.5時，加入不同濃度的IPTG(0.8和1.0 mmol/L)分別誘導培養 3.0、3.5、4.0、4.5 h 以確定蛋白適宜表達條件。在優化后的誘導條件下大量誘導表達菌液200 mL，離心收集菌體于－40℃保存備用。

1.7 表達產物的純化和Western blot分析 將誘導表達后的產物于室溫融化，加入10 mL PBS重懸浮，離心棄上清后加10 mL過柱緩沖液(20 mmol/L Tris-HCL，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DDT，pH=7.4)冰浴超聲 10 min。4 ℃8000 g離心5 min后分別取上清和沉淀行SDSPAGE，電泳后考馬斯亮藍R250染色并觀察。超聲后的上清液經0.22 μm濾紙過濾并過Amylose樹脂預裝柱(按儀器操作步驟進行)，最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCL，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L maltose，1 mmol/L DDT，pH=7.4)洗脫收集蛋白，SDS-PAGE觀察純化結果。電泳后將純化蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂牛奶封閉1 h;封閉后加入SFTSV急性期患者血清(按1∶50稀釋)孵育1 h，同時以健康人血清作為對照;加堿性磷酸酶(AP)標記的鼠抗人IgG(按1∶1000稀釋)孵育1 h顯色觀察。

1.8 ELISA方法的建立與檢測效果的評價 用包被緩沖液將純化的 NP稀釋至10 mg/L，每孔150 μL包被酶標板，4℃過夜，PBST洗滌3次;加入150 μL 封閉液37 ℃封閉2 h，加入100 μL 待測血清(按1∶10稀釋)37℃孵育30 min;洗板后加入100 μL HRP標記羊抗人 IgM(按1∶1000稀釋)，37℃反應30 min;每孔分別加入底物TMB溶液和顯色液50 μL，37℃反應10 min;最后加入終止液50 μL。酶標儀于450 nm處測定OD值。對48例健康人血清樣本進行檢測，以P/N≥2.1為陽性判定標準值，以建立的ELISA法和實時熒光定量PCR法(逆轉錄50℃30 min;95℃預變性15 min;95℃變性15 s，60℃退火40 s并收集FAM熒光信號，40個循環。檢測結果Ct值≤35為陽性)同時對96份SFTSV感染者樣本進行檢測，確定ELISA方法的可靠性。

2 結果

2.1 目的基因的擴增 測序結果顯示，SFTSV NP的基因長度為738 bp。該基因與GenBank上Orthobunyavirus 69號分離株(登錄號JF682778.1)的NP基因序列完全相同。

2.2 重組表達載體 pMAL-c2x-NP的鑒定pMAL-c2x-NP小提質粒后經XbaⅠ、HindⅢ雙酶切獲得結果相一致的目的條帶(圖1)，表明重組表達質粒構建成功。

2.3 重組蛋白的表達、純化和Western blot分析不同濃度的IPTG均可誘導目的蛋白的表達，隨著誘導時間的增加，融合蛋白的表達量有所增加，表達量差異并不明顯(圖2)。該實驗選取IPTG終濃度為1 mmol/L，誘導表達4 h。融合蛋白的可溶性結果分析顯示，目的蛋白雖然主要以包涵體形式表達，但上清中可溶性重組蛋白含量可滿足通過Amylose樹脂預裝柱純化的需要(圖3)。Western blot結果顯示SFTSV感染者血清與融合蛋白在約70000處有一條特異雜交帶，融合蛋白對識別SFTSV感染者血清具體良好的特異性(圖4)。

圖1 pMAL-c2x-NP的酶切鑒定結果

圖2 不同誘導條件下pMAL-c2x-NP的表達

圖3 重組蛋白的可溶性分析結果

圖4 純化融合蛋白的Western blot分析

2.4 ELISA方法的檢測效果 48份健康人血清抗NP抗體OD值的平均值=0.099。以建立的方法對96例臨床診斷SFTSV急性期患者血清標本進行檢測，陽性率為40.6%(39/96);實時熒光定量 PCR法檢測的陽性率為55.2%(53/96)。兩者符合率為77.1%，一致性檢驗較好，見表1。

表1 2種檢測方法檢測結果的一致性檢驗

3 討論

近年來，蟲媒病毒嚴重威脅著人類的健康[8]。作為一種蜱傳新發傳染病，目前已建立多種針對SFTSV的實驗室檢測方法，包括病毒分離、RT-PCR、IFA以及實時熒光定量PCR等[9-10]，而上述方法對實驗設備和實驗人員都有較高的要求。血清學的檢測既能彌補基層實驗條件的不足，又可用于流行病學調查。NP在病毒顆粒內通過與病毒基因組RNA和RNA聚合酶結合形成NP體(ribonucleoprotein，RNP)，同時又具有同型寡聚化和RNA結合的特性，這些特性使得NP在病毒的轉錄、復制過程中起著重要的作用。針對SFTSV構建的合成噬菌體抗體庫的研究[11]表明，94種人源多克隆抗體均可識別SFTSV的NP，而不與外膜蛋白發生反應。研究[12]也顯示利用SFTSV感染者血清檢測NP的病毒顆粒和重組蛋白，結果均呈現強陽性，而其他的靶標蛋白如外膜蛋白等結果具有不穩定性，可見NP特異性抗體在SFTSV感染者血清中的表達水平較高。針對NP的單克隆抗體研究[13-14]也顯示在檢測臨床病例中NP較高的親和力與高度的特異性，這些都證明NP在SFTSV早期診斷過程中起著至關重要的作用。而河南、山東、湖北等地發現的SFTSV基因組序列高度同源，這為后續實驗的廣泛應用提供了保障。

有研究[15]利用pEASY-E1表達系統獲取蜱傳森林腦炎病毒的非結構蛋白。該實驗采用的原核表達載體pMAL-c2x含有強啟動子tac，可以高效表達外源蛋白。作者在實驗過程中發現上清中融合蛋白的表達量完全可滿足純化的需要，這可能是該載體具有E.coli malE翻譯起始信號，可引導融合蛋白穿過胞質膜進入周質有關。MBP的相對分子質量為42000，因此NP的相對分子質量大約在28000，與文獻[12]報道一致。利用該蛋白構建的ELISA檢測方法和實時熒光定量法對臨床血清樣本檢測的結果符合率為77.1%。研究[16]顯示當血清樣本采樣時間小于3 d時，僅能通過實時熒光定量PCR檢測;同時由于ELISA方法在實驗條件方面還需進一步優化，這可能是兩者結果差異的原因。

該研究通過構建SFTSV NP基因的原核表達載體，優化融合蛋白的表達條件，經過親和層析后獲得純化的重組融合蛋白。經Western blot證實該融合蛋白具有抗原性，用建立的ELISA方法對臨床樣本做了初步檢測，為后續的SFTSV血清學檢測試劑的研發提供了物質基礎。

[1]Xu B，Liu L，Huang X，et al.Metagenomic analysis of fever，thrombocytopenia and leukopenia syndrome(FTLS)in Henan Province，China:discovery of a new bunyavirus[J].PLoS Pathog，2011，7(11):e1002369

[2]Yu XJ，Liang MF，Zhang SY，et al.Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China[J].N Engl J Med，2011，364(16):1523

[3]許汴利.新布尼亞病毒感染致發熱伴血小板減少綜合征的發現、認識與啟示[J].中華預防醫學雜志，2012，46(2):99

[4]李德新.發熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒概述[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2011，25(2):81

[5]Fafetine JM，Tijhaar E，Paweska JT，et al.Cloning and expression of Rift Valley fever virus nucleocapsid(N)protein and evaluation of a N-protein based indirect ELISA for the detection of specific IgG and IgM antibodies in domestic ruminants[J].Vet Microbiol，2007，121(1/2):29

[6]Jansen van Vuren P，Potgieter AC，Paweska JT，et al.Preparation and evaluation of a recombinant Rift Valley fever virus N protein for the detection of IgG and IgM antibodies in humans and animals by indirect ELISA[J].J VirolMethods，2007，140(1/2):106

[7]Saijo M，Qing T，Niikura M，et al.Recombinant nucleoprotein-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of immunoglobulin G antibodies to Crimean-Congo hemorrhagic fever virus[J].J Clin Microbiol，2002，40(5):1587

[8]徐志凱，戚中田，胡福泉，等.重要病原微生物研究進展及展望[J].解放軍醫學雜志，2010，35(9):1061

[9]Sun Y，Liang M，Qu J，et al.Early diagnosis of novel SFTS bunyavirus infection by quantitative real-time RT-PCR assay[J].J Clin Virol，2012，53(1):48

[10]黃學勇，杜燕華，李幸樂，等.新布尼亞病毒IgG抗體間接免疫熒光檢測方法的建立[J].中華預防醫學雜志，2012，46(2):165

[11]Yu L，Zhang L，Sun L，et al.Critical epitopes in the nucleocapsid protein of SFTS virus recognized by a panel of SFTS patients derived human monoclonal antibodies[J].PLoS One，2012，7(6):e38291

[12]盧靜，李川，張福順，等.發熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒結構和非結構蛋白表達研究[J].病毒學報，2011，27(6):515

[13]徐言，曾曉燕，焦永軍，等.發熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核衣殼蛋白單克隆抗體的制備及初步應用[J].免疫學雜志，2012，28(4):282

[14]劉艷，金柯，韓亞萍，等.發熱伴血小板減少綜合征患者血清中核蛋白抗體的動態變化[J].現代生物醫學進展，2013，13(18):3432

[15]宋天一，李菁華，張哲，等.蜱傳森林腦炎病毒非結構蛋白1原核表達載體的構建[J].吉林大學學報:醫學版，2013，39(3):620

[16]杜燕華，黃學勇，王海峰，等.實時熒光PCR法與ELISA法在發熱伴血小板減少綜合征病例檢測中的比較[J].中國人獸共患病學報，2013，29(1):101