黃芪多糖對人紅白血病K562細胞凋亡的影響*

李 超，錢新華，千新來，付琳琳，吳 余

1)南方醫科大學南方醫院新生兒科 廣州 510515 2)新鄉醫學院病理學教研室 新鄉 453003

白血病是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，白血病細胞的生長特點是增殖失控、凋亡受阻及分化障礙[1]。黃芪為豆科植物屬蒙古黃芪、膜莢黃芪的干燥根，黃芪多糖(astragalus polydsaccharide，APS)是黃芪的主要活性成分之一[2-3]，具有增強機體免疫功能、強心降壓、降血糖、抗應激、抗病毒、抗輻射、抗氧化等多種藥理功效[4-8]。研究[7-8]發現APS在體內外對多種惡性腫瘤有明顯的抑制作用。許杜娟等[8]發現，黃芪總提取物能明顯抑制小鼠實體型腫瘤的生長，并可引起肝癌細胞系發生凋亡;而劉兵榮等[9]研究發現，APS可通過抑制核因子NF-κB表達而抑制大鼠腦出血后的細胞凋亡，提示APS與細胞凋亡的關系及相關機制值得深入研究。作者采用流式細胞術、Caspase-3活性測定等方法，通過RT-PCR和 Western blot方法檢測 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、IAP-1和Smac mRNA和蛋白的表達，探討APS對人紅白血病K562細胞凋亡的影響及機制，以期為APS用于白血病的治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系來源及培養 K562細胞購自中科院上海細胞庫，用含體積分數10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和青/鏈霉素(青霉素 100 U/mL，鏈霉素100 mg/L)的RPMI 1640培養基，于37℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養。

1.2 主要試劑 FBS為杭州四季青公司產品;RPMI 1640培養基、Trizol試劑、100 bp DNA Marker為美國Invitrogen產品;RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs為日本TaKaRa公司產品;所有抗體及增強化學發光(ECL)試劑盒均為美國Santa Cruz公司產品;Annexin V-FITC/PI試劑盒購于碧云天生物技術研究公司;CaspACETM Assay System、Colorimetric試劑盒為Promega公司產品。

1.3 PCR引物序列和目的片段長度 PCR引物由英濰捷基上海公司合成。引物序列和目的片段長度見表1。

表1 PCR引物序列和目的片段長度

1.4 細胞凋亡的檢測 收集K562細胞(對照組)和200 mg/L APS誘導48 h的K562細胞(APS組，根據預實驗結果選擇該劑量和時間)并計數細胞數。用195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入 5 μL Annexin V-FITC，避光孵育 10 min，1000 r/min 離心 5 min，棄上清，用 190 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，避光冰上孵育后，上流式細胞儀計數凋亡細胞數。實驗設3個平行樣本。

1.5 細胞中Caspase-3活性測定 提取對照組和APS組K562細胞總蛋白并定量。按試劑盒說明書進行Caspase-3活性測定。96孔板中依次加入如下成分制備反應混合物:Caspase分析緩沖液32 μL、二甲基亞砜 2 μL、二硫蘇糖醇(100 mmol/L)10 μL、蛋白 62.5 μg，補水至 98 μL。每組均設 3 個復孔，同時設不加蛋白的空白對照孔。加AC-DEVA-PNA底物2 μl/孔，避光，37 ℃溫育 4 h，測定 405 nm 處的光密度值(OD)，計算各組均值，并以各組均值與空白對照均值的差值表示Caspase-3活性。

1.6 細胞中凋亡相關基因mRNA的RT-PCR檢測 提取對照組和APS組K562細胞總RNA并定量，體外合成cDNA第一條鏈，以cDNA為模板進行PCR反應。通過Bandleader 3.0軟件分析PCR擴增產物目的條帶與內參照條帶的灰度比值。

1.7 細胞中凋亡相關基因蛋白的Western blot檢測 提取對照組和APS組K562細胞總蛋白并定量，通過Western blot方法檢測細胞凋亡相關基因蛋白。以β-actin為內參照。上樣量為100 μg，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bcl-XL多克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體、兔抗人Smac多克隆抗體、兔抗人IAP-1多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根酶標記的山羊抗兔二抗和辣根酶標記的兔抗鼠二抗的稀釋度分別為 150、100、150、150、100、300、2500和2500倍。通過Bandscan 5.0軟件分析目的條帶灰度值與內參照條帶灰度值的比值。

1.8 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析。應用兩獨立樣本的t檢驗比較2組K562細胞凋亡細胞數及細胞中 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、IAP-1 和 Smac mRNA和蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 APS對K562細胞凋亡的影響 APS組K562細胞凋亡數(3322.000±413.849高于對照組(101.333 ±18.339)，差異有統計學意義(t=13.466，P ＜0.001)。

2.2 APS對K562細胞中Caspase-3活性的影響與對照組(0.085±0.018)相比，APS組 K562細胞中 Caspase-3 活性(0.354 ±0.036)升高(t=11.562，P ＜0.001)。

2.3 APS 對 K562 細胞中 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1表達的影響 見圖1、2和表2、3。

圖1 APS對K562細胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1 mRNA表達水平的影響

圖2 APS對K562細胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1蛋白水平表達的影響

表2 2組細胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1 mRNA的表達

表3 2組細胞中 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和 IAP-1蛋白的表達

3 討論

正常情況下細胞的增殖與凋亡處于動態平衡中，以維持機體的自身穩定性。細胞增殖失控和(或)凋亡受阻均可導致腫瘤發生。細胞凋亡受一系列基因調控。Caspase家族是調控細胞凋亡的關鍵分子，其家族成員均具有半胱氨酸蛋白酶活性，其中Caspase-8和Caspase-9位于凋亡途徑的上游，分別介導死亡受體途徑和線粒體途徑細胞凋亡，Caspase-3為凋亡的效應因子，被稱為凋亡“執行者”，它們的級聯激活引發細胞發生凋亡[10-11]。研究[12]發現，許多中藥或其有效成分可誘導腫瘤細胞凋亡。該研究結果顯示，APS組K562細胞凋亡數高于對照組;與對照組相比，APS組K562細胞中Caspase-3活性顯著增加，說明APS能誘導K562細胞發生凋亡。

Bcl-2家族是對Caspase的激活進行調控的一類重要的蛋白因子，Bcl-2家族蛋白主要通過線粒體途徑參與凋亡調控。根據在凋亡中所起作用，可將Bcl-2家族蛋白分為兩大類型:抑制凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(如 Bax等)。Bcl-2、Bcl-XL可抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，而Bax通過其編碼產物與Bcl-2蛋白形成異源二聚體使其失活，從而激活Caspase或獨立地破壞核內染色質，引起細胞凋亡[13-14]。谷俊朝等[15]研究發現，APS 可抑制乳癌中Bcl-2的表達，促進乳癌細胞的凋亡。該研究結果顯示，與對照組相比，APS組K562細胞中Bcl-2在mRNA和蛋白水平的表達均顯著降低，而Bax在mRNA和蛋白水平表達均顯著增加，Bcl-XL在mRNA和蛋白水平的表達差異均無統計學意義。說明APS誘導K562細胞凋亡的機制可能與其下調Bcl-2的表達和上調Bax的表達密切相關，而Bcl-XL可能在APS誘導K562細胞凋亡中不起重要作用。

研究[16]發現，Smac可通過與IAPs結合或通過增強IAPs的自身泛素化降解以釋放Caspases而發揮其促凋亡活性。反之，Livin、XIAP等也可通過減少Smac的釋放或誘導Smac的泛素化降解而發揮抑制凋亡的作用[17-18]。該研究結果顯示，與對照組相比，APS組K562細胞中IAP-1在mRNA和蛋白水平的表達均顯著降低，而Smac在mRNA和蛋白水平表達均顯著增加。IAP-1表達下調和Smac表達上調在APS誘導K562細胞凋亡中也發揮重要作用。

綜上所述，APS可以誘導K562細胞凋亡，APS的上述作用與抗凋亡基因Bcl-2和IAP-1表達下調及促凋亡基因Smac和Bax表達上調有密切關系。但APS誘導K562細胞凋亡的分子機制可能非常復雜，值得進一步深入研究。

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