KLK14基因沉默對OVCAR-3細(xì)胞凋亡和遷移能力的影響*

張瑞濤，史惠蓉，任 芳，陳志敏，賈艷艷，馮 巍

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052

人組織激肽釋放酶(kallikrein-related peptidase，KLK)家族包含15種結(jié)構(gòu)同源的絲氨酸激酶，其基因定位于染色體19q13.4，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和組織重構(gòu)等一系列生理過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。KLK14又稱類組織激肽釋放酶6，具有胰島素樣和糜蛋白酶樣雙重作用，能降解膠原Ⅳ等細(xì)胞外基質(zhì)，可能與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和浸潤等有關(guān)[3]。研究[4]表明，KLK14在卵巢癌和乳癌等多種上皮性腫瘤組織中異常高表達(dá)。作者采用RNA干擾技術(shù)抑制KLK14在人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對細(xì)胞凋亡和遷移的影響，初步探討KLK14與卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的關(guān)系及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人卵巢癌 SK-OV-3、OVCAR-3和HO-8910細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，預(yù)實驗中已證實KLK14基因和蛋白在OVCAR-3細(xì)胞中的表達(dá)均高于SK-OV-3和 HO-8910細(xì)胞，故選用OVCAR-3細(xì)胞為后續(xù)實驗細(xì)胞。Trizol購自美國Invitrogen公司。cDNA第一鏈合成試劑盒為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品，2×Taq Master Mix為上海萊楓生物公司產(chǎn)品。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物序列，交上海生物工程公司合成。TUNEL試劑盒購自德國Roche公司，8 μm Transwell小室購自美國Millipore公司。KLK14 shRNA質(zhì)粒、control shRNA質(zhì)粒、Transfection Reagent、山羊抗人KLK14多克隆抗體、鼠抗人MMP2單克隆抗體和鼠抗人MMP9單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。鼠抗人β-actin、鼠抗人Caspase-3和鼠抗人Caspase-9單克隆抗體、IP及WB蛋白提取液、ECL發(fā)光試劑盒均購自江蘇碧云天公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 OVCAR-3細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。按照Transfection Reagent說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前1 d，換取不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基后調(diào)整OVCAR-3細(xì)胞密度為2×105mL－1，以每孔2 mL接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞50% ～70%融合時，分為3組，實驗組和對照組更換為新鮮配制的含KLK14 shRNA或?qū)φ誷hRNA的無抗生素、無血清培養(yǎng)基，空白組僅加入同種培養(yǎng)基。孵育6 h后加入體積分?jǐn)?shù)20%的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h后用于后續(xù)實驗。

1.3 RT-PCR Trizol提取細(xì)胞總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。KLK14上游引物 5'-ACGCACCCCAACTA CAACTC-3'，下游引物 5'-GAACTCCTGCACAGAC CATG-3'(283 bp);β-actin上游引物 5'-ACGCAC CCCAACTACAACTC-3'，下游引物 5'-TCTCCTTAAT GTCACGCACGA-3'(372 bp)。PCR反應(yīng)體系:模板cDNA 1 μL，2 × Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各 1 μL，無 RNase H2O 定容至 25 μL。RT-PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);72℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠(混有EB)電泳，Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)采集、分析圖像，以KLK14/β-actin比值表示目的基因的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

1.4 TUNEL實驗 在載玻片上滴加單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)4～6 h至細(xì)胞貼壁后，以40 g/L多聚甲醛固定30 min，體積分?jǐn)?shù)0.3%過氧化氫甲醇阻斷30 min，體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton X-100孵育2 min，然后按TUNEL試劑盒說明書處理細(xì)胞，DAB染色后封片，高倍鏡下選取5個視野，每個視野計數(shù)每100個細(xì)胞中凋亡小體的數(shù)目，取均數(shù)，計算凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞遷移實驗 制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104mL－1，每組設(shè)3個孔，Transwell小室上室加入細(xì)胞懸液，200 μL/孔，下室加入含體積分?jǐn)?shù)20%血清的培養(yǎng)基，500 μL/孔，培養(yǎng)6 h后甲醇固定5 min，蘇木素染色30 min。擦去上室細(xì)胞后倒置小室，倒置顯微鏡下選取5個高倍視野計數(shù)遷移細(xì)胞后取均數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blot 收集細(xì)胞，IP及WB蛋白提取液提取細(xì)胞總蛋白，各取40 μg總蛋白進(jìn)行100 g/L SDS-PAGE電泳，20 V恒壓半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過夜，分別用KLK14抗體(按 1∶500稀釋)、β-actin抗體(按1∶400稀釋)、Caspase-3(按1∶500稀釋)、Caspase-9(按1∶1000稀釋)、MMP2(按1∶600稀釋)和MMP9(按1∶600稀釋)室溫孵育1.5 h。二抗采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)IgG(按1∶5000稀釋)，室溫孵育1.5 h，ECL發(fā)光試劑盒處理后曝光。Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)采集、分析圖像，以目的蛋白/β-actin的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較空白組、對照組和實驗組OVCAR-3細(xì)胞中KLK14 mRNA與蛋白及 Caspase-3、Caspase-9、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的差異以及細(xì)胞凋亡率和遷移細(xì)胞數(shù)的差異，組間兩兩比較采用 Bonferroni檢驗，檢驗水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞中KLK14 mRNA和蛋白的表達(dá)見圖1、表1。

2.2 3組細(xì)胞凋亡率比較 空白組、對照組和實驗組OVCAR-3細(xì)胞的凋亡率分別為(4.7±2.1)%、(7.3 ±2.1)%和(30.3 ±2.9)%，實驗組 OVCAR-3細(xì)胞的凋亡率明顯高于其他2組細(xì)胞(F=54.313，P ＜0.001)，見圖2。

圖1 3組細(xì)胞中KLK14 mRNA和蛋白的表達(dá)

表1 3組OVCAR-3細(xì)胞中KLK14 mRNA及蛋白的表達(dá)

2.3 3組細(xì)胞遷移能力比較 空白組、對照組和實驗組OVCAR-3遷移細(xì)胞數(shù)分別為(67.7±2.5)、(66.0 ±5.3)和(29.7 ±3.8)個，實驗組 OVCAR-3細(xì)胞遷移能力低于其他2組(F=85.283，P=0.013)，見圖3。

2.4 3 組細(xì)胞中 Caspase-3、Caspase-9、MMP2 和MMP9蛋白的表達(dá)比較 見圖4、表2。

圖2 3組細(xì)胞的凋亡情況(DAB，×400)

圖3 3組細(xì)胞的遷移情況(蘇木素，×400)

圖4 3組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)

表2 3組OVCAR-3細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、MMP2和 MMP9蛋白的表達(dá)

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來其死亡率高居婦科惡性腫瘤之首[5]。作者所在的課題組的前期研究[6-7]顯示，卵巢上皮性癌組織中存在KLK14的高表達(dá)，KLK14的異常表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。KLK14基因在多種惡性腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中存在異常表達(dá)，例如乳腺、卵巢、前列腺、睪丸、肺、結(jié)腸、唾液腺等部位的惡性腫瘤組織，并與相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及疾病的預(yù)后有密切關(guān)系[8-14]。

在惡性腫瘤的發(fā)病中抵抗程序性細(xì)胞死亡以及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的激活是大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞生理學(xué)特點的重要共性改變[15]。目前，KLK14基因與卵巢癌細(xì)胞凋亡和遷移的關(guān)系尚不清楚。

該研究中作者采用KLK14shRNA轉(zhuǎn)染OVCAR-3細(xì)胞后，OVCAR-3細(xì)胞中 KLK14 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞凋亡率升高，遷移能力受抑。此外，該研究結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)染KLK14 shRNA的OVCAR-3細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因caspase-3和caspase-9的表達(dá)明顯增加，與細(xì)胞侵襲和遷移性能相關(guān)的MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)明顯降低。上述結(jié)果亦印證了下調(diào)KLK14表達(dá)可抑制卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的惡性行為。

綜上所述，KLK14基因受到抑制后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞的遷移能力;KLK14可作為卵巢癌治療干預(yù)的目標(biāo)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究KLK14基因與卵巢癌的關(guān)系，有助于進(jìn)一步闡明卵巢癌發(fā)病的分子機(jī)制，從而為卵巢癌的治療干預(yù)提供新的分子生物學(xué)靶點。

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