埃克替尼對ACC-M細胞凋亡的影響

楊彩玲，張景航，任銘新，張應花，崔衛剛#

1)新鄉醫學院第一附屬醫院口腔外科 衛輝 453100 2)新鄉醫學院病理科 新鄉 453003 3)新鄉醫學院人體解剖學教研室 新鄉 453003

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是涎腺最常見的惡性腫瘤之一，具有浸潤性強、易遠處轉移的特點，預后較差。埃克替尼是中國自主研發的一種靶向表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)。研究[1-2]發現，EGFR 和活性氧(reactive oxygen species，ROS)參與了小細胞肺癌等疾病的發生。ROS產生與清除間的動態平衡對維持細胞的生存與凋亡非常重要。抗氧化酶是清除ROS引起的氧化損傷的主要成員;MnSOD能歧化超氧陰離子形成過氧化氫，清除ROS引起的氧化損傷，是線粒體中重要的抗氧化酶[3-4]。作者觀察了埃克替尼對ACC-M細胞凋亡以及MnSOD在線粒體的表達和對ROS生成的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ACC-M細胞株由上海交通大學口腔醫學院惠贈。ACC-M細胞培養于含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的培養液中，置于體積分數5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養，每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。埃克替尼由浙江貝達藥業有限公司惠贈，用DMSO溶解，分裝后－20℃保存。DCFH-DA試劑(Molecular Probes公司)，Caspase-3活力檢測試劑盒(Sigma公司)，MnTMPyP(Calbiochem Merk公司)，兔抗MnSOD一抗(Santa Cruz公司)，抗兔二抗(KPL公司)。

1.2 細胞分組 實驗分為6組:對照組，低、中、高劑量埃克替尼組(10、20、40 μmol/L 埃克替尼處理 24 h)，MnTMPyP 組(10 μmol/L MnTMPyP 處理 24 h)，MnTMPyP+埃克替尼組(10 μmol/L的MnTMPyP預孵育1 h，再加入40 μmol/L埃克替尼處理24 h)。

1.3 ACC-M細胞Caspase-3蛋白活力的檢測 根據試劑盒說明書步驟進行。收集處理后的各組細胞，在冰上用裂解液孵育30 min，16000 r/min 4℃離心10 min，收集上清液，用底物37℃孵育90 min，Caspase-3活力用分光光度計在405 nm進行測量。標準曲線的繪制:試劑盒提供的4-硝基苯胺用標準品稀釋液稀釋為 0、10、20、50、100 和 200 μmol/L，作為標準品并繪出標準曲線，與標準曲線對比計算樣品中Caspase-3蛋白的活力。實驗重復3次。

1.4 ACC-M細胞活性的檢測 向各孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，37℃孵育4 h，1000 r/min離心5 min，棄去培養液，加入相應藥物進行干預，振蕩10 min，測定490 nm波長處的吸光度。細胞活性=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。實驗重復3次。

1.5 ACC-M細胞ROS水平的檢測 ROS含量用DCFH-DA熒光探針進行檢測。細胞在含10 mmol/L DCFH-DA的培養基中孵育30 min，經埃克替尼和(或)MnTMPyP處理細胞后，熒光分光光度計測定細胞內ROS水平值(激發波長488 nm，發射波長530 nm)。ROS水平=實驗組熒光強度/對照組熒光強度×100%。實驗重復3次。

1.6 ACC-M細胞總蛋白、線粒體及胞質中Mn-SOD蛋白表達水平的檢測 細胞線粒體和胞質蛋白提取參照線粒體提取試劑盒說明書進行。收集各組處理后的細胞，加入預冷的Mito-cytoBuffer重懸細胞，1000 r/min離心5 min。取上清，4℃、1000 r/min離心5 min。再取上清，4℃、12000 r/min離心10 min。取上清即為胞質，提取胞質蛋白，用于胞質蛋白成分的檢測。線粒體沉淀位于管底，加入0.2 mL Mito-CytoBuffer重懸，12000 r/min離心10 min，棄上清;全細胞蛋白裂解緩沖液重懸沉淀，測蛋白濃度，保存備用。采用BCA法測定提取蛋白濃度，配置體積分數5%濃縮膠和10%分離膠進行蛋白電泳，電泳結束后電轉移到PVDF膜，加入兔抗MnSOD一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗 10 min×3次，加入抗兔二抗，室溫孵育2 h，ECL發光、顯影和定影。β-actin為內參。成像分析儀掃描并保存，目的蛋白的表達水平用目的蛋白和內參蛋白灰度值的比值表示。實驗重復3次。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0處理數據，采用單因素方差分析比較各組細胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS的水平及MnSOD蛋白表達水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組細胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS水平的比較 見表1。由表1可見，不同濃度的埃克替尼可以抑制ACC-M細胞活性，誘導ACC-M細胞Caspase-3的活力增加，促進ACC-M細胞ROS的生成，而MnTMPyP可拮抗上述變化。

表1 各組細胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS水平的比較(n=3) %

2.2 各組細胞總蛋白、線粒體及胞質中MnSOD蛋白的表達水平 見圖1，表2。埃克替尼處理引起了MnSOD由線粒體向細胞質的釋放。MnTMPyP預處理ACC-M細胞1 h能逆轉埃克替尼引起線粒體Mn-SOD向胞質的轉位。

圖1 各組細胞MnSOD蛋白的表達

表2 各組細胞線粒體和胞質MnSOD蛋白的表達比較(n=3) %

3 討論

細胞凋亡是基因控制的細胞主動死亡過程。目前認為，細胞凋亡與腫瘤的發生發展關系密切。Caspase-3通過抑制DNA修復，啟動DNA的降解，導致細胞死亡。埃克替尼是一種EGFR-TKI，可抑制人鱗狀上皮細胞癌A431細胞系等腫瘤細胞的生長和增殖[5-6]。該研究結果顯示:埃克替尼在較低濃度時即可抑制ACC-M細胞的增殖，誘導ACC-M細胞中Caspase-3凋亡相關蛋白的活力增加，說明埃克替尼能誘導ACC-M細胞發生凋亡。

ROS與腫瘤形成密切相關，是多種藥物誘導細胞發生凋亡的一個重要信號分子。研究[7-8]顯示ROS與EGFR-TKI促腫瘤細胞凋亡的作用有關。該研究發現，埃克替尼可促進ACC-M細胞ROS的產生，與上述研究相符。此外，該研究還發現利用MnTMPyP預處理ACC-M細胞1 h能阻斷埃克替尼誘導的凋亡相關蛋白Caspase-3活力的增加，表明ROS在埃克替尼誘導ACC-M細胞凋亡過程中發揮著重要作用。

MnSOD是線粒體中非常重要的抗氧化因子。MnSOD歧化超氧陰離子形成過氧化氫，使超氧陰離子失去氧化能力。MnSOD蛋白先在胞質中翻譯形成然后轉位到線粒體;MnSOD蛋白的正確定位對其發揮功能非常重要[9]。該研究顯示，MnSOD模擬物MnTMPyP能夠阻斷埃克替尼誘導凋亡相關蛋白Caspase-3活力的增加，據此推測，MnSOD可能在埃克替尼誘導ROS生成過程中發揮著重要作用。此外，該研究還顯示埃克替尼處理后，MnSOD蛋白在ACC-M細胞線粒體的表達減少，在胞質中的表達增加。推測MnSOD從線粒體向胞質的轉位可能參與了埃克替尼誘導的細胞凋亡;MnSOD不能及時清除線粒體呼吸鏈上產生的氧離子，從而引起細胞ROS的積累。

綜上所述，埃克替尼誘導了Caspase-3蛋白活力增強和ROS的生成，ROS在埃克替尼誘導ACC-M細胞凋亡過程中發揮著重要作用，該作用可能與MnSOD從線粒體向胞質轉位有關。

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