胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白的表達

張曉峰，張連峰，程 鵬

鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052

胃癌起源于胃黏膜上皮細胞，在胃的各個部位均可發生。胃癌在世界范圍內居腫瘤發病率的第4位，腫瘤死亡率的第2位[1]。中國是胃癌發病率和死亡率較高的國家之一。近年來腫瘤干細胞理論受到人們越來越多的關注。該理論認為腫瘤干細胞是原發性腫瘤組織中一類具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細胞亞群，是腫瘤生長、轉移、復發的根源[2]。Wnt信號通路參與組成干細胞信號網絡，與腫瘤的發生發展有關[3]。Wnt1為人類 Wnt基因家族中的第1個成員。研究[4]發現，多個生物學過程中存在Wnt1的異常、異位表達，包括細胞分化、細胞的極性形成、細胞遷移和增殖，表明Wnt1與人類多個系統腫瘤密切相關。作為Wnt信號通路的靶基因，G蛋白偶聯受體Lgr5主要表達于肌肉、胎盤、脊髓、腦組織中。近年研究[5]發現Lgr5為腫瘤干細胞標記物之一，在多種腫瘤組織中過表達[6]。作者在該研究中聯合檢測了胃腺癌組織和相應癌旁正常組織中Wnt1和Lgr5蛋白的表達，探討二者在胃腺癌發生發展中的作用，為臨床診斷、治療及判斷預后提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取鄭州大學第一附屬醫院2012年1月至2013年2月外科手術切除后的存檔石蠟標本76例，所有標本均經病理明確診斷為胃腺癌。76例患者中男47例，女29例;年齡29～78歲，中位年齡54歲;均接受胃癌根治術，術前均未行放、化療和生物免疫治療;分化程度:高、中分化腺癌31例，低分化腺癌45例;臨床分期:Ⅰ、Ⅱ期45例，Ⅲ、Ⅳ期31例;有淋巴結轉移43例。同時取其中30例患者的癌旁正常胃組織作為正常對照。

1.2 Lgr5和Wnt1蛋白的免疫組化檢測 Lgr5和Wnt1兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，即用型SP試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。體積分數10%甲醛固定標本，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，常規脫蠟，高溫高壓修復，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。Lgr5和Wnt1一抗均按1∶100稀釋，用PBS代替一抗作空白對照，用已知陽性切片作陽性對照。結果判斷:Lgr5陽性染色主要分布于胞膜或胞質內，可見均勻一致的棕色顆粒。每張切片選取5個高倍視野，每個視野計數200個細胞，記錄其中的陽性細胞數，陽性細胞百分比＜10%為陰性，≥10%為陽性。Wnt1陽性染色分布于細胞胞膜和胞質中，呈棕黃色或棕褐色。每張切片選取5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，陽性細胞數＜5%為陰性，≥5%為陽性。免疫組化染色結果由兩位高年資病理科醫師在雙盲條件下進行評定。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0處理數據。采用χ2檢驗比較胃腺癌和癌旁正常胃組織Lgr5和Wnt1蛋白表達的差異以及不同一般人口學特征及臨床病理特征的胃腺癌患者Lgr5和Wnt1蛋白表達的差異，采用列聯系數分析胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白表達的關系。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 胃腺癌組織及癌旁正常組織中Lgr5和Wnt1蛋白的表達 見圖1、表1。

2.2 不同一般人口學特征及臨床病理特征的胃腺癌患者Lgr5和Wnt1蛋白的表達比較 見表2。由表2可知，Lgr5和Wnt1的表達與患者的性別和年齡無關，與腫瘤的大小、TNM分期、分化程度以及淋巴結轉移情況有關。

圖1 胃腺癌組織(A)及癌旁正常組織(B)中Lgr5和Wnt1蛋白的陽性表達(SP，×200)

表1 胃腺癌組織和癌旁正常胃組織中Lgr5、Wnt1蛋白的表達比較 陽性例數(%)

表2 不同一般人口學特征及臨床病理特征的胃腺癌患者Lgr5和Wnt1蛋白的表達比較 陽性例數(%)

2.3 胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白表達的關聯性 見表3。胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白的表達呈正關聯。

表3 胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白表達的關聯性 例

3 討論

腫瘤干細胞具有無限增殖潛能決定著腫瘤的發生發展和轉移，同時也是腫瘤復發、轉移和治療失敗的根源。Wnt信號通路廣泛作用于機體生長發育過程，參與人體的胚胎發育、干細胞的增殖分化以及腫瘤的形成[7]。G蛋白偶聯受體Lgr5是Wnt信號通路的靶基因，為近年發現的腫瘤干細胞標記物之一。Lgr5蛋白由907個氨基酸組成，含有17個富含亮氨酸重復序列的外功能區為其特征性結構。Becker等[8]發現，正常胃腸組織中Lgr5的表達僅僅局限于隱窩基底部，即腸干細胞巢內;而在癌前病變組織中，Lgr5的表達明顯升高，并且陽性表達的細胞并不局限于隱窩基底部，這一結果表明腫瘤形成和惡變的早期事件是Lgr5陽性細胞離開干細胞巢，因此Lgr5在腫瘤的發生過程中可能有重要作用。Tanese等[9]發現Lgr5與基底細胞癌的發生密切相關。目前多認為干細胞的Wnt信號通路異常激活后，引起靶基因lgr5的表達升高，可促進干細胞的增殖分化和惡性轉化，最終導致腫瘤的形成。該研究結果顯示Lgr5在癌旁正常胃黏膜少量散在表達，主要分布在胃腺體的底部及頸峽部，而在胃癌組織中，Lgr5的表達升高，并隨著分化程度的降低、淋巴結的轉移以及浸潤范圍和深度的加大加深而升高。目前對Lgr5在信號轉導、干細胞的激活和腫瘤形成等過程中的具體作用機制尚不清楚，仍需進一步研究。

Wnt1為Wnt基因家族中發現的第1個成員。1982年首先從小鼠乳癌組織中克隆出這種基因。人類Wnt1基因定位于12q12～12q13，共編碼370個氨基酸序列。Wnt通路是一種對細胞增殖和分化具有重要調節作用的信號轉導系統，有多種分子參與并相互影響及制約[10]。Wnt1作為此通路中的重要成員之一，是信號轉導的始動因子;由于它在胚胎發育、腫瘤發生等重要的病理生理過程中扮演著關鍵角色，所以目前受到廣泛關注。研究[11]發現在Wnt通路中，Wnt1蛋白分泌后作用于細胞表面基質及其特異性受體卷曲蛋白，再經其下游散亂蛋白磷酸化和去磷酸化過程來完成Wnt信號傳遞，組成Wnt途徑。很多腫瘤的發生與Wnt信號異常相關，在胃癌的發生發展中也不乏Wnt信號通路異常的報道[12]。該研究結果顯示Wnt-1蛋白在胃癌組織中高表達，并且Wnt1在胃癌組織中的表達與癌組織分化程度、大小、浸潤深度及淋巴結轉移有關，與既往相關研究[13-14]結果相似。因此Wnt-1可以作為評價胃癌生物學行為較好的指標，同時也為抗癌藥物的研究提供了新靶點。

此外，該研究結果還顯示，作為Wnt信號通路的靶基因和參與經典Wnt信號通路的重要成員，Lgr5和Wnt1關系密切，推測二者在胃癌的發生發展、浸潤和轉移過程中可能具有協同作用。尋找敏感的、特定的腫瘤分子標志物在臨床腫瘤研究中仍是一個重大的挑戰，尤其針對胃癌臨床預后差這一事實[15]。Lgr5和Wnt1有望為胃癌的早期診斷和基因治療提供新的切入點。

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