結核分枝桿菌重組fbpB編碼蛋白的原核表達

石 潔，朱巖昆，馬曉光，王少華，李 輝，邢 進#，閆國蕊，靳曉偉

1)河南省疾病預防控制中心 鄭州 450016 2)新密市疾病預防控制中心 鄭州 452370

結核病(TB)是由結核分枝桿菌感染所引起的一種高發病率和病死率的傳染病。目前，全球大約三分之一的人口被結核桿菌所感染，其中有5%～10%的潛伏感染者會發展至活動性肺結核。據估計，每年有900萬的活動性肺結核的新發病例，并且每年有200萬人死亡[1-2]。中國是TB高負擔國家之一，結核病人數僅次于印度而居世界第2位。BCG作為一種活性減弱的牛分枝桿菌，是目前惟一有效的結核病抗原，對感染分枝桿菌的動物模型有很強保護作用。盡管BCG抗原對患有結核性腦膜炎和粟粒性肺結核等重癥結核的兒童有很好的保護作用，然而不同研究[3]顯示，BCG在不同人群中的保護性不穩定，對成人肺結核的保護效率介于0%～80%。結核桿菌分泌蛋白中，Ag85復合物家族成員(Ag85A、B、C)被認為是最具潛力的疫苗候選物[4]，并且Ag85A和Ag85B的應用最廣。該研究以Ag85B為研究對象，將其編碼基因fgbB連接至含有His標簽的原核表達載體，并將體外高效表達純化的重組蛋白用于患者的免疫學檢測，為進一步研究TB的早期診斷和免疫疫苗的開發奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑 結核分枝桿菌H37Rv標準菌株，E.coil BL21(DE3)，E.coil DH10B，原核表達載體pET28a均由河南省疾病預防控制中心結核病參比實驗室保存。分子生物學和常規生化試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司。His純化珠子購自GE公司，膠回收試劑盒、50 bp DNA Ladder Marker、T4 DNA連接酶、限制性內切酶購自TaKaRa公司。

1.2 結核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B原核表達載體的構建 根據編碼結核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B的基因fbpB序列設計引物如下:上游5'-GGGCG GATCCATGACAGACGTGAGCCGAAAG-3'，下 游 5'-GATCGAATTCGCCGGCGCCTAACGAACT-3'，分別引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。提取H37Rv基因組DNA，并作為模板，PCR擴增fbpB基因，切膠回收目的片段，經 BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切后，與pET28a載體連接反應過夜。連接產物轉化至E.coil DH10B的感受態細胞中，菌落PCR篩選陽性克隆pET28a-fbpB，并送至上海英俊測序公司進行測序鑒定。

1.3 Ag85B蛋白的原核表達和純化 將測序正確的重組質粒pET28a-fgbB轉化至E.coil BL21菌株中，挑取單克隆菌落接種于3 mL LB液體培養基中37℃振蕩過夜，1∶100擴大培養至 A600nm大約為0.6，加入IPTG誘導，觀察不同的溫度和不同時間下的誘導結果。離心收集菌體沉淀，加入含有蛋白酶抑制劑的PBS裂解緩沖液，冰浴超聲后，分別取上清和沉淀，用120 g/L的SDS-PAGE蛋白膠進行垂直電泳檢測。IPTG純化誘導培養重組菌50 mL，離心后加入含有蛋白酶抑制劑PMSF的PBS超聲破碎液，離心取上清。加入His純化柱4℃反應過夜，用His banding buffer洗滌2次后，加入 His washing buffer進行洗脫。取上清進行SDS-PAGE和Western blot鑒定。

1.4 純化蛋白的Western blot鑒定 制備100 g/L的SDS-PAGE凝膠，恒壓80 V電泳20 min，轉換至恒壓130 V繼續電泳60 min，按照Bio-Rad公司的半干轉移的方法，恒流60 mA電泳轉膜30 min，將SDS-PAGE凝膠上的蛋白質電轉移到PVDF膜上。PVDF膜用50 g/L脫脂奶粉孵育1 h，以降低蛋白質與抗體之間的非特異性結合。用鼠源His一抗(稀釋2000倍)于4℃孵育過夜，TBST洗滌3次后，再用稀釋1000倍的兔抗鼠二抗在室溫條件下孵育2 h，用TBST洗滌后加入底物進行顯色或者曝光。當蛋白帶的顏色深度達到要求時終止反應。

1.5 ELISA檢測純化蛋白對患者的免疫原性 將純化的融合蛋白His-Ag85B蛋白分別與27例臨床可疑結核病患者血清(由新密市結核病防治所提供)進行ELISA試驗。將純化的His-Ag85B用碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6)稀釋至蛋白質含量為1 mg/L。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 mL，4℃過夜。棄去孔內抗原，用PBST洗滌3次后，體積分數3%的牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉1 h，洗滌后加入患者稀釋100倍的血清37℃孵育反應2 h。再次洗滌3次后加入稀釋10000倍HRP偶聯的兔抗人的二抗37℃孵育反應1 h，洗滌后加入底物于37℃反應30 min顯色。用2 mol/L的H2SO4終止反應，在ELISA檢測儀上于450 nm處以空白對照孔調零后測各孔吸光度(A)值，大于規定的陰性對照A值的2.1倍為陽性。

2 結果

2.1 重組質粒pET28a-fbpB的鑒定 所有挑取的克隆均能擴增出目的基因大小一致的1000 bp左右條帶，初步鑒定為陽性克隆，見圖1。為排除PCR擴增造成假陽性，選取經初步鑒定的一個陽性克隆用BamHⅠ/EcoRⅠ進行雙酶切。該質粒經雙酶切后可釋放1000 bp左右的目的條帶，進一步表明了重組質粒的正確性(圖2)。對該克隆進行DNA測序比對，其序列與標準序列完全一致。

圖1 重組質粒pET28a-fbpB菌落的PCR鑒定

圖2 重組質粒pET28a-fbpB的酶切鑒定

2.2 Ag85B重組蛋白的純化和鑒定 經His純化后的總蛋白考馬斯亮藍染色后，在35000左右有明顯的亮帶(圖3)，為帶His標簽的目的蛋白Ag85B。Western blot結果顯示，在相對分子質量35000處有明顯反應條帶的，為His融合的Ag85B目的蛋白(圖4)。

圖3 融合蛋白純化后的SDS-PAGE鑒定

圖4 融合蛋白的Western blot檢測

2.3 Ag85B重組蛋白對結核病患者的ELISA檢測結果 15個胸片診斷陽性疑似肺結核患者血清在450 nm的A值均在0.78以上，平均為0.83。所有非結核患者樣本的A值均小于0.08，平均為0.05。純化的Ag85B-His融合蛋白能較好地檢測結核病患者血清標本。

3 討論

肺結核是嚴重危害人類健康的主要傳染病[5-8]。近年來，隨著流動人口的增加，耐多藥菌株數量增多以及結核病和艾滋病的雙重感染，使得結核病的防控形勢更加嚴峻。目前結核病的化療方案遠非理想，需要長期攝入多種抗結核藥物。由于目前化療方案的副作用大，治療周期長，容易導致貧窮患者的依從性差，治療失敗，引起耐藥菌株的出現[7]。因此，亟待開發結核病更加快速有效的治療方案。由于大多數感染者并不發病，只有大約10%的潛伏感染者會發展為活動性肺結核[9]，因此，在這種情況下，使用免疫療法，可能成為結核病抗菌化學療法的重要輔助手段。DNA疫苗可建立細胞免疫反應，因此成為預防和治療結核病的新熱點。

結核桿菌抗原Ag85復合物是快速生長結核分枝桿菌的主要分泌蛋白，含量占到所有分泌蛋白的30%[10]，其含有 3種編碼不同但抗原相關的蛋白[11]。Ag85通過介導結核桿菌與T細胞的纖維黏連蛋白相結合，從而調節了結核菌素的延遲超敏反應[12]。近年來，研究[13]表明 Ag85B 作為一種 DNA疫苗，可有效地抑制小鼠肺組織中結核桿菌的生長。

為進一步研究Ag85B的免疫學功能，該研究通過基因重組技術將早期分泌抗原Ag85B的編碼基因fbpB克隆到含有His的pET28a載體上，并通過原核表達和純化得到了重組蛋白His-Ag85B。采用ELISA法檢測該重組蛋白對結核病患者血清的免疫原性，發現其對結核病患者的血清樣本能特異性地識別，以上結果為進一步研究Ag85B的免疫學功能提供了初步的實驗基礎。

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