人乳頭瘤病毒E6／E7mRNA bDNA檢測在宮頸疾病篩查中的應用

王少蕾 王筱紅 羅麗雅 吳開鋒 廣東省博羅縣婦幼保健院 516100

婦科常見惡性腫瘤其中之一為宮頸癌，其發病率較高，為女性腫瘤發病率的第二位。我國解放初期，巴氏涂片開展普遍，宮頸癌發病得到較好控制，巴氏涂片在宮頸癌篩查歷史中起到了很大的作用。因近20余年來對于宮頸癌篩查不重視，宮頸癌發病有升高的趨勢，且農村地區經濟相對欠發達，農村發病率增高趨勢更加明顯。由于衛生知識等多方面因素，該病在較年輕婦女中發病亦趨增加，新發病例仍較高，占全世界發病率的28%。眾多數據表明，導致宮頸癌發生的主要原因是人乳頭瘤病毒（HPV）感染。眾多流行病學、分子生物學等研究結果表明，宮頸癌的根本致病因素是人乳頭瘤病毒（HPV）感染，HPV有百余種亞型，其中高危型 HPV與宮頸癌的相關性較高，有證據表明，其相關性要高于吸煙與肺癌的相關性，宮頸癌中95%是由它引起［1］。HPV與宮頸癌的關系因此受到醫學界的廣泛關注。在宮頸癌治療方面，宮頸癌的治療效果明顯差于癌前病變。若能早期診斷和治療宮頸癌前病變，患者的生存率及生存質量可明顯提高，也可減少宮頸癌的浸潤，降低宮頸癌的死亡率。目前國家重大公共衛生項目的兩癌篩查（宮頸癌和乳腺癌）可早期篩查出宮頸癌前病變，以便于早期治療，以達到上述目的。因此，宮頸癌的防治關鍵在于篩查出更多的癌前病變，以便于早期治療，婦科普查工作的現實意義也在于此。目前宮頸癌的篩查方法較多，基于其HPV與宮頸癌的關系，筆者擬探討基于HPV的檢測手段來更好的早期發現宮頸癌前病變和宮頸癌。

1 對象與方法

1.1 對象 選取我縣所轄鄉鎮2013年1－12月的兩癌篩查農村婦女中經過初步篩查懷疑存在宮頸疾病者為研究對象，年齡30～65歲，平均年齡（40.2±7.3）歲。有子宮切除手術史或宮頸手術史，或有盆腔放射治療史的剔除在外，且目前無妊娠，在取標本前無性生活達3d以上，亦無陰道沖洗及放藥。

1.2 方法 對患者進行HPV E6／E7mRNA bDNA檢測和TCT檢測，最后均行宮頸病理學檢查。

1.2.1 HPV E6／E7mRNA bDNA檢測。（1）儀器和試劑：科蒂亞生物有限公司電熱恒溫鼓風干燥箱、冷光儀、宮頸高危HPV E6／E7mRNA檢測試劑盒（即宮頸穩態檢測試劑盒）。（2）操作方法：用細胞采樣器的中央刷毛部分輕輕地深插入子宮頸管內，按同一個時針方向轉動采樣器5～8周后，將收集的細胞放入細胞保存液中。將標本移入離心管，3 000r／min離心5min后倒掉上清液，用2ml去離子水（ddH2O）清洗后再次離心，去上清液，達到標本同質化的目的。將已處理的有細胞的離心管中加入裂解混合液（200μl裂解液和400ml ddH2O，混合比例為1∶2），用移液槍吹打細胞團，使細胞分散懸浮，再加入5μl蛋白酶K。放入65℃恒溫箱中放置1h，裂解過程中進行2～3次震蕩，1h后取上清液用于檢測（附注：多人份時裂解液的配置可以一次配置多量，按照細胞裂解液和去離子水1∶2的比例，如92人份：19ml裂解液＋38ml ddH2O。混勻后分別取600μl到標本中，切記蛋白酶K不能混合入上述稀釋的裂解液中，每個標本單獨加入固定的5μl）；從已制備好的標本裂解液中取出實驗所需量。1例患者取50μl裂解后的標本用于檢測。檢測緩沖液配置→布板→信號放大→讀板。從4℃冰箱取出底物復溫。復溫后加入底物催化劑31.5μl，手搖混勻。將雜交板從溫箱中取出，掀開封板貼紙，用1×洗脫液200μl洗板洗3次。將所配底物每孔加入100μl，放入46℃溫箱保溫20min后取出，上科蒂亞冷光儀檢測。將所讀數據，轉入數據處理軟件進行電腦計算，結果將顯示定性結果。

1.2.2 研究對象進行TCT檢測。（1）使用TCT專門的采樣器來采集子宮頸細胞樣本；（2）獲得脫落細胞后浸入液基細胞處理試劑中進行處理；（3）將有效細胞制備成細胞懸液，通過過濾離心方法清除黏液對制片的干擾，制成脫落細胞薄片；（4）用HE染色、巴氏染色或其他免疫組織化學染色等方法使細胞著色；（5）在顯微鏡下通過人工觀察分析來檢查陰道或宮頸的細胞形態。

1.2.3 研究對象進行病理學檢查。在陰道鏡下直接活檢取材，取材后用福爾馬林液固定后送廣東省婦幼保健院病理科檢測，得出病理學結果。

1.3 統計學處理 采用sigmastat3.1軟件進行統計分析，不同程度宮頸病變中兩種方法檢測的陽性率比較采用χ2檢驗。以病理檢查結果為參照分為正常組、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌共五組，對比 HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT兩種檢測方法在該五組中的準確度及假陽性率。

2 結果

不同人群HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT檢測結果的比較，見表1。

表1 不同人群HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT檢測結果的比較〔n（%）〕

本文對象共223例為可疑宮頸疾病患者，以最終病理學結果對其分為正常、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌共五組，對該五組患者的HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT檢測結果進行比較，發現正常組中HPV E6／E7mRNA bDNA假陽性率為46.9%（15／32），明 顯低于 TCT 的假 陽性率62.5%（20／32），P＜0.05，具有統計學意義。而CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌組的HPV E6／E7mRNA bDNA的陽性率均明顯高于TCT組，P＜0.05，具有統計學意義。

3 討論

HPV是DNA病毒的一種，其DNA分為3個部分，檢測主要是早期基因區（E）。早期基因蛋白分為E1、E2、E4、E5、E6、E7等，其功能有病毒的轉錄、翻譯調控和細胞轉化復制，而主要的致癌基因為E6、E7。

HPV型別較多，有高危型、低危型，目前已發現的有百余種亞型，其中生殖道感染有近30種亞型，部分涉及腫瘤的發生。其中與子宮頸腫瘤有關的型常常是高危型HPV，低危與高危HPV分型與病毒導致宮頸癌發生的危險有關。其中低危型HPV感染是導致生殖道疣的主要原因。而高危型常引起宮頸癌及子宮頸上皮內瘤變（CIN）［2］，最常見的HPV分型是16、18亞型。有研究表明，地域性差異是HPV感染亞型分布的一個特點，如西方國家及非洲國家，16、18、58和52型引起的宮頸癌所占比例低于亞洲國家［3］。

宮頸黏膜屬鱗狀上皮組織，是HPV易感部位。宮頸細胞中的HPV DNA有兩種存在狀態：整合和游離狀態。病毒存在的狀態決定了宮頸病變的程度，DNA處于游離狀態一般為癌前病變期，當DNA病毒與宿主細胞的染色體整合時，表明已進入癌癥進展期。E6、E7基因有負相調節作用。因E2為結合位點啟動，導致HPV E6、E7基因負相調節作用消失，細胞生長進入調控失常期，E6、E7基因發生表達異常。而HPV E6和E7蛋白在病毒復制中起到至關重要的作用，進而導致細胞的無限增殖和惡性轉化［4］。p53Rb蛋白是細胞周期調節因子，當與E6、E7蛋白結合，就起到致癌的作用了。p53是腫瘤抑制的重要蛋白，是細胞生長周期中的負調控。當其基因表達上調時，會促進靶基因p21合成大幅度提高，抑制細胞增殖，這時宿主細胞DNA發生損傷。E6蛋白與細胞內E6－AP結合，再與p53特異性地結合在一起，進而水解，使其喪失了細胞生長負調節功能，從而引起細胞無限增生并向惡性轉化［4，5］。有文獻表明E6不僅和上述蛋白相互作用，同時還與靶蛋白1、p21、干擾素調控因子3相互作用，同時也參與細胞凋亡。E7蛋白轉化蛋白，與腫瘤抑制蛋白視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）親和力很高，Rb與E7結合使Rb－E2F復合物解離，游離出E2F，使轉錄因子立即發揮作用，細胞周期失控而發生永生化［4］。同時，E7還可以使得突變增加。這就是HPV致癌的機理。

在臨床治療來說，與宮頸癌前病變和微小浸潤癌相比較，宮頸浸潤癌治療的難度遠比癌前病變困難，部分患者的生活質量較差。宮頸癌是一種感染性癌癥，如果通過選擇一種好的篩查方法，及時發現癌前病變，可以高效阻斷宮頸癌的發生。或發現微小浸潤癌，也可以有效提高宮頸疾病患者的生存率和生存質量，這正是筆者尋找宮頸癌篩查手段的意義所在。

目前，宮頸癌的篩查已經作為我國重大公共衛生項目，開展較普及，因為成本問題，初步篩查的主要手段是巴氏涂片法，以TBS報告形式，或液基細胞學（TCT）檢測，部分經濟發達地區，采用HPV檢測進行篩查，或者高危人群采取HPV檢測，有學者也提出液基細胞學與HPV同時檢測，但篩查費用較高，不適宜普及。宮頸癌篩查的方法還有陰道鏡檢查、組織病理學檢查、血清學方法等［6］，損傷性、準確度太低、假陰性率高等都是上述方法的缺點。故此要尋找更好的辦法以提高準確性?？茖W尋找宮頸癌篩查手段，以便于早期進行監測和干預，同時進行早期治療，這對于降低宮頸癌的發病率和死亡率有不可估量的意義。

目前檢測HPV－DNA的方法有，（1）聚合酶鏈反應技術：通用引物PCR；間接原位PCR；熒光定量PCR；實時PCR；PCR－ELISA檢測，直接原位PCR；PCR結合雙向點雜交技術檢測，單管巢式PCR；競爭性定量PCR。（2）核酸雜交技術：斑點雜交法、80uthern雜交法、熒光原位雜交法等。（3）雜交捕獲技術。（4）SP法染色檢測 HPV早期蛋白E6［6，7］等基因芯片技術。這些方法具有各自的缺點，如標本的要求高，操作過程繁雜，且標本容易污染、假陽性較高；大規模應用于臨床，價格昂貴。綜上所述，為了提高特異性、降低假陽性率、提高準確率，又能夠大規模用于篩查，兼顧價格的合理性，筆者必須尋找新的檢測方法。

已經知道宿主細胞惡性轉化的主要原因是致癌蛋白HPV E6／E7整合入宿主的基因組，導致E6／E7mRNA的表達失控，引起惡性轉化，檢測這種致癌基因的轉錄具有不必重復進行檢測即能鑒定高危反復感染者的潛力［8］。在宮頸疾病的早期篩查中價值明顯增高。

E6／E7存在于HPV中，是癌基因的片段。而導致宿主細胞惡性轉化的是病毒癌基因轉錄產物mRNA［9］；宿主細胞本身不發生癌變的前提是癌基因不表達；宮頸上皮組織中具有癌基因活性的是HPV E6／E7mRNA；E6／E7可抑癌基因p53和Rb的降解，從而干擾細胞周期調節［10］；癌變水平與HPV E6／E7mRNA表達的多少成正比例關系。因此要對感染HPV高危型的婦女進行宮頸癌風險評估選用宮頸細胞中HPV E6／E7mRNA的檢測更具意義。bDNA技術原理是基于“三明治”核酸雜交技術。此項技術優勢：（1）擴增特點及擴增過程不是呈指數增長，從而穩定性高；（2）具有確定的放大倍數，重復性亦較高；（3）能精確的檢測mRNA數量；（4）能監測其動態水平。傳統技術中的不確定因素、過程復雜及種種缺陷在該方法中都被克服。直接用特定裂解液將樣本裂解后，經探針雜交與信號放大即可得到結果，具有快速性及更高的精確度等優點。

本文表明HPV E6／E7mRNA bDNA在宮頸癌篩查中假陽性率明顯低于TCT的假陽性率，而CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌組的HPV E6／E7mRNA bDNA的陽性率均明顯高于TCT組，均有統計學意義。故此，人乳頭瘤病毒E6／E7 mRNA bDNA檢測是目前宮頸癌篩查中較好的方法，具有較好的準確度，假陽性率亦低，可能更能評估宮頸癌的發病風險。

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