糖皮質激素對內毒素耐受的影響

張麗麗，趙欣欣，楊 琦，閔 睿，王宗謙

0 引言

內毒素又名脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭陰性菌菌壁的主要成分，具有廣泛的生物學活性，可通過激活相關受體介導信號通路調控炎癥及免疫系統。當機體受到內毒素打擊時，可誘導多種細胞(主要為單核巨噬細胞系統)活化并產生多種促炎因子，如腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-a，TNF-α)、白細胞介素 1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-8、干擾素 γ 等，以及多種抗炎介質，如 IL-10、轉化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)、糖皮質激素(glucocorti-coid，GC)等，參與機體免疫炎癥反應，使機體出現如發熱、體重下降，嚴重時可致膿毒癥、系統性炎癥反應綜合征，甚至多器官功能障礙綜合征等。然而，預先予機體小劑量的LPS刺激，機體對隨后大劑量或致死量LPS攻擊呈現出低反應甚至無反應的現象，這種現象稱為內毒素耐受。內毒素耐受的形成避免了機體產生持續過度的炎癥反應，對機體是一種保護作用。內毒素耐受的發生機制目前尚未完全清楚。LPS通過引起內源性糖皮質激素釋放，抑制促炎因子基因轉錄［1-2］。糖皮質激素可能參與內毒素耐受的發生機制。然而，糖皮質激素對內毒素耐受的形成起到促進還是抑制作用，目前不同的研究結論不同。本實驗將通過不同時間點給予外源性糖皮質激素-地塞米松干預，觀察其對內毒素耐受的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8～12周齡雌性昆明鼠，體重26～38 g，購于中國醫科大學實驗動物中心，SPF級，飼養于中國醫科大學附屬第四醫院動物室獨立通風籠具系統，標準滅菌復合飼料及純凈水飼養，室內自然溫度及光照。主要試劑:脂多糖(LPS，O55:B5)(寶信生物公司)，地塞米松磷酸鈉注射液(天津藥業焦作有限公司)，TNF-α ELISA kit(博士德)，IL-10 ELISA kit(博士德)。

1.2 昆明鼠分組 Ⅰ組:對照組(20只)，分為ⅠA組:健康對照(10只)、ⅠB組:單次直接致死劑量LPS(2LD50=8 mg/kg)對照組(10只);Ⅱ組:標準內毒素耐受組(6只);Ⅲ組:高劑量Dex干預組(12只)，ⅢA組為初始LPS刺激前高劑量Dex干預組(6只)，ⅢB組為終末致死量LPS前高劑量Dex干預組(6只);Ⅳ組:低劑量Dex干預組(12只)，ⅣA組為初始LPS刺激前低劑量Dex干預組(6只)，ⅣB組為終末致死量LPS前低劑量Dex干預組(6只)。

1.3 各組處置 ⅠA組小鼠:連續5 d腹腔注射0.9%氯化鈉注射液(0.5 mL/d)。ⅠB組小鼠:連續4 d腹腔注射0.9%氯化鈉注射液(0.5 mL/d)，第5天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)。Ⅱ組小鼠:連續 4 d 腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第5 天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)。ⅢA組小鼠:連續4 d 腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第 1 天注射LPS前1 h腹腔注射Dex(10 mg/kg)，第5天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg);ⅢB組小鼠:連續4 d 腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第 5 天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)，注射致死量LPS前1 h腹腔注射Dex(10 mg/kg)。ⅣA組小鼠:連續4 d腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第 1 天注射 LPS前1 h腹腔注射Dex(1 mg/kg)，第5天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)。ⅣB組小鼠:連續4 d腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第 5 天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)，注射致死量LPS前1 h腹腔注射Dex(1 mg/kg)。于第5天注射致死量LPS后3 h采用摘眼球法取血標本，留取血清，4℃保存，次日檢測血清細胞因子。

1.4 TNF-α和IL-10水平測定 取血清標本，依照博士德ELISA kit說明書具體操作，檢測OD值，應用curve exert 1.3軟件繪制標準曲線，求得濃度值。

1.5 統計學分析 應用SPSS 18.0軟件分析，計量資料均采用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

①ⅠA組 TNF-α、IL-10水平極低，ⅠB組TNF-α、IL-10水平較ⅠA組顯著增高，差異有統計學意義。Ⅱ組TNF-α、IL-10水平較ⅠB組顯著下降，差異有統計學意義，但仍高于ⅠA組，見表1。②Dex干預組TNF-α水平與標準內毒素耐受組比較(表2):ⅢA、ⅣA組 TNF-α 水平與Ⅱ組 TNF-α水平差異無統計學意義(P＞0.05)，ⅢB、ⅣB組TNF-α水平低于Ⅱ組TNF-α水平，差異有統計學意義(P＜0.05)。③Dex干預組IL-10水平與標準內毒素耐受組比較(表2):ⅢA、ⅣA組IL-10水平高于Ⅱ組IL-10水平，差異有統計學意義(P＜0.05)，ⅢB、ⅣB組IL-10水平與Ⅱ組IL-10水平差異無統計學意義(P＞0.05)。由于部分血樣溶血或獲取血清量少，檢測血清樣本數量與各組小鼠數量有差異。

表1 健康對照組、LPS對照組及標準內毒素耐受組TNF-α、IL-10水平比較

表2 地塞米松干預各組與標準內毒素耐受組TNF-α、IL-10 水平比較

3 討論

內毒素耐受現象是生物在長期進化中形成的一種保護性調節機制，以避免機體產生持續過度的炎癥反應，是機體防御機制的重要組成部分［1］。此外，在生命的早期過程中不可避免地接觸到的環境內毒素對機體免疫耐受的調節也具有重要作用［3］。人工誘導針對內毒素的免疫耐受可能具有改善自身免疫性疾病的作用［3-5］。內毒素耐受現象的機制目前沒有被完全闡明，大量研究表明，單核巨噬細胞系是內毒素作用的主要靶細胞，此外，樹突細胞與內毒素耐受也具有密切關系。內毒素信號轉導主要為Toll樣受體4(TLR4)識別后與髓樣分化因子-88(MyD88)銜接，進一步與白介素-1受體相關激酶(IRAKs)、TNF受體相關因子-6(TRAF-6)作用，激活NF-κB誘導激酶(NIK)和絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)，導致NF-κB和JNK活化，轉錄因子向核內易位，基因表達，最終導致炎癥因子的釋放。目前主要認為內毒素耐受與TLR4表達下調、IRAK水平下調、MAPK活性降低、NF-κB 活化障礙具有相關性［1］。

GC常被用于治療感染性休克、全身炎癥反應綜合征等，以減輕炎癥反應，GC的應用也將影響到內毒素耐受形成。GC對機體免疫系統具有廣泛而重要的調節作用。GC對誘導內毒素耐受的作用仍存在爭議。Glenn等［6］研究表明，切除腎上腺的鼠不能形成對LPS的耐受，通過補充外源性糖皮質激素能夠恢復鼠對LPS的耐受能力。Raquel等［7］研究表明，在Dex條件下，樹突細胞保持在未成熟狀態，促進免疫耐受。Rearte等［2］研究表明，內毒素耐受的持久性依賴于GC，但Dex對內毒素耐受的形成具有抑制作用。上述這些體外或動物實驗研究結果不盡相同，這可能與內毒素耐受產生過程的復雜性相關，可能研究結果只來自于內毒素耐受的一個特殊階段，或與應用不同的動物模型、選擇外源性糖皮質激素干預的方法不同、應用試劑及檢測方法不同相關。

TNF-α被認為與內毒素耐受密切相關，目前絕大部分研究表明，機體第一次受到LPS刺激時TNF-α顯著升高，形成內毒素耐受時TNF-α升高水平明顯降低，機制可能與內毒素耐受時IRAKs表達下降，IRAK/MyD88結合被抑制，NF-κB活化障礙相關［1］。Rearte等［2］通過抗 TNF-α 抗體不能改變LPS誘導耐受的實驗說明了TNF-α與內毒素耐受雖然相關，但其不是耐受建立的相關責任細胞因子。盡管對TNF-α是否能誘導耐受觀點不一致，但內毒素耐受時TNF-α升高水平顯著降低這一事實是絕大數研究公認的，本實驗同樣證實了，當小鼠第一次受到LPS刺激時，TNF-α水平顯著升高，多次LPS干預，形成內毒素耐受，小鼠受到致死量LPS打擊時TNF-α升高水平明顯下降。外源性糖皮質激素-地塞米松能夠抑制TNF-α的產生，我們設想在建立內毒耐受形成過程中在不同的時間點予Dex干預，是否仍能夠抑制TNF-α的產生，促進內毒素耐受。實驗結果表明，在初始LPS刺激前1 h，給予高劑量Dex(10 mg/kg)或低劑量Dex(1 mg/kg)干預均不影響TNF-α水平，即在較早期給予Dex干預，并不影響接下來內毒素耐受的建立。然而，終末致死量LPS前高劑量或低劑量Dex干預能顯著降低TNF-α水平，即注射致死量內毒素前1 h腹腔注射Dex能進一步降低TNF-α水平，對內毒素耐受有促進作用，同時也說明了1 mg/kg Dex與10 mg/kg Dex劑量對TNF-α水平影響無顯著差異，這一實驗結果與Glenn等［6］認為Dex對內毒素耐受起到是促進作用的結論一致，但不同點在于其動物模型為腎上腺切除鼠，除外了內源性糖皮質激素的干擾，其結論認為在初始LPS刺激前予Dex能恢復內毒素耐受能力。然而本實驗結果表明，在終末致死量LPS攻擊前的一定時段內Dex干預能通過降低TNF-α水平促進內毒素耐受，而過早給予Dex干預則不能對內毒素耐受的TNF-α水平產生顯著影響。

IL-10作為抗炎細胞因子在調節炎癥免疫反應中具有重要作用。Randow等［8］通過體外實驗證實，人體單核細胞的耐受可以通過IL-1、IL-10、TGF-β前處理被部分模仿，在耐受過程中應用抗IL-10或抗TGF-β抗體可阻止這一現象產生，而IL-10缺失則會使樹突細胞缺乏對LPS的反應，損毀免疫耐受［9］，由此提示IL-10是內毒素耐受形成過程中的重要細胞因子。然而，有研究表明，IL-10基因敲除小鼠仍能產生內毒素耐受［10］，此結果提示我們IL-10的存在并不是內毒素耐受的必要條件。Rearte等［2］的研究也認為IL-10并不是耐受維持至關重要的細胞因子，在小鼠產生內毒素耐受時，其體內僅有低水平的IL-10。IL-10對內毒素耐受形成的作用目前不是十分明確，在內毒素耐受形成時IL-10水平是升高還是降低，目前仍無一致的結論。本實驗表明，當小鼠第一次受到LPS刺激時IL-10水平顯著升高，多次LPS刺激，形成內毒素耐受，小鼠IL-10升高水平明顯下降，這一結果與Rearte等所得結論相一致，提示IL-10可能參與內毒素耐受的形成。在終末致死量LPS前予高劑量Dex(10 mg/kg)或低劑量Dex(1 mg/kg)干預均不顯著影響IL-10水平;但在終末致死量LPS刺激前96 h給與Dex干預，使機體在內毒素耐受形成時產生IL-10水平增高，推測Dex對IL-10調控作用可能需要較長時間，但對內毒素耐受時的TNF-α水平沒有顯著影響，說明IL-10不是形成內毒素耐受的決定性細胞因子。

內毒素耐受產生機制至今仍未完全明確。目前可通過多次LPS刺激建立內毒素耐受動物模型，本實驗分別于初始LPS刺激前和終末致死量LPS前予高/低劑量Dex干預內毒素耐受形成過程，通過檢測小鼠體內TNF-α、IL-10水平變化，間接推斷Dex對內毒素耐受的影響，結合初始LPS刺激前予高劑量Dex或低劑量Dex干預不影響TNF-α水平，但能升高 IL-10水平，終末致死量LPS前高劑量Dex或低劑量Dex干預能降低TNF-α水平，但不影響IL-10水平。我們可得出初步結論，終末致死量LPS前較短時間內予以Dex干預可能對促進內毒素耐受更有意義，同時也提示Dex劑量過高可能不會帶來更多受益，IL-10對內毒素耐受的形成可能不具有決定作用。結合臨床，應用大劑量激素可增加副作用發生風險，在高劑量激素與低劑量激素對內毒素耐受作用無差異的情況下，我們可以考慮應用小劑量激素治療感染性休克/敗血癥患者可能帶來更多臨床受益，這一結論與Annane等［11］主張低劑量糖皮質激素治療敗血癥相一致。糖皮質激素對內毒素耐受形成的影響值得深入研究。

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