高效液相色譜法測定土霉素片的含量

張亞茹，何玉川，張 英

0 引言

土霉素片原標準WS1-C2-0002-89中的含量測定采用抗生素微生物檢定法的管碟法。因其方法操作繁瑣，影響因素諸多，檢驗時間較長，尤其不利于生產企業中間產品的質量控制，為了更有效地控制該藥品質量，本文采用了高效液相色譜法測定土霉素片的含量，方法準確、快速、簡便，重復性好。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀日立L-2000;電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);紫外可見分光光度計 TU-1901(北京普析通用儀器有限責任公司);酸度計 FE20K(梅特勒托利多儀器有限公司);土霉素標準品874 U/mg(中國藥品生物制品檢定所，批號:0305-200720);土霉素片:吉林市鹿王制藥股份有限公司、赤峰蒙欣藥業有限公司、天津天士力(遼寧)制藥有限公司。色譜純乙腈，自制超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱:Diamonsil C18(2)5 μm 250×4.6 mm 色譜柱;柱溫:30℃;流動相:0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈=81∶19(用磷酸調pH為2.0);流速0.8 mL/min;檢測波長:353 nm;進樣量:20.0 μL;土霉素峰與相鄰雜質峰的分離度大于2.0。

2.2 供試品溶液與對照品溶液的制備 取土霉素片10片，精密稱定，研細，稱取適量用鹽酸溶液(0.1 mol/L)溶解、過濾，制成20 μg/mL的溶液，作為供試品溶液。另精密稱取土霉素標準品適量同法制成20 μg/mL的對照品溶液。

2.3 空白干擾試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、稀釋劑各20.0 μL分別注入高效液相色譜儀，在供試品溶液的液相色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應的位置上有相應的色譜峰，而稀釋劑色譜圖中在此位置并無色譜峰，證明本方法可行，稀釋劑無干擾。見圖1。

3 結果

圖1 HPLC色譜圖

3.1 線性關系考察 精密稱取土霉素標準品適量至50 mL量瓶中，加鹽酸溶液(0.1 mol/L)溶解并稀釋至刻度，得到標準品儲備液0.05 mg/mL。分別精密量取上述標準品儲備液 1、2、3、4、5、6 mL至10 mL量瓶中，加鹽酸溶液(0.1 mol/L)稀釋至刻度，分別吸取上述各標準品溶液20.0 μL注入高效液相色譜儀中，測定峰面積(753940、1494132、2276211、3073063、3816665、4612532)，以土霉素標準品的濃度為X軸，液相峰的峰面積為Y軸繪制線性關系圖，并計算線性關系方程。回歸方程為 y=154 614x-34 651，相關系數 r=0.999 9，說明土霉素標準品的濃度在 5～30 μg/mL范圍內線性關系良好。

3.2 穩定性試驗(10 h) 精密吸取供試品溶液，分別在 0，2，4，6，8 h 進樣測定，結果供試品峰面積的RSD%為0.9%(n=5)，說明樣品溶液在10 h內的穩定性良很好。

3.3 精密度試驗 精密吸取2.2項下的標準品溶液20.0 μL，依法連續進樣6次并測定。結果土霉素標準品主成分的色譜峰面積的RSD%為0.5%(n=6)，表明本方法的精密度很好。

3.4 重復性試驗 稱取同一供試品，按2.2項下方法制備供試品溶液6份依法測定其含量，結果平均值為98.8%，RSD%為0.3%，表明本方法重復性良好。

3.5 加樣回收率試驗精密稱取已知含量(含量98.8%，平均片重0.459 6 g)的供試品粉末9份，每份約7.5 mg，分成3組，每組3份，分別置9個100 mL的容量瓶中，第1組、第2組、第3組每瓶精密加入土霉素標準品溶液(100 μg/mL)分別為5、10、15 mL，再加入鹽酸溶液(0.1 mol/L)稀釋至刻度，制成供試品溶液，依法測定，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

3.6 樣品含量測定 按2.2方法操作，以外標法計算土霉素的含量。結果3批樣品中130911、130315、20130501含土霉素分別為標示量的98.8% ，97.4% ，96.5% 。

4 討論

4.1 檢測波長的確定 現在用高效液相色譜法測定土霉素片含量的文獻很多，參考文獻中檢測波長也各不相同，如有 267、268、254、280、353、355、350 nm等，比較混亂，本文選取在測定土霉素時的最佳檢測波長做了下述實驗。

取土霉素標準品，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.02 mg的溶液，照紫外-可見分光光度法在200～400 nm波長處進行掃描，結果在268.5 nm和353.1 nm波長處均有最大吸收，但在268.5 nm左右處有稀釋劑雜質峰的影響，而高效液相色譜法所用的也是紫外檢測器，故選取353 nm為最佳檢測波長。

4.2 用于流動相中試劑種類的選擇及pH選擇文獻中用于高效液相色譜法測定土霉素的流動相試劑種類也很多，如草酸銨、N，N-二甲基甲酰胺、磷酸氫二銨、磷酸二氫鈉、枸櫞酸等，本研究本著簡單易得既保證檢驗質量，又降低實驗成本的原則，選擇了本文中用于流動相的試劑種類。

對所用流動相分別考察了pH4.8(未進行pH值的調節時)、pH 4.0、pH 3.0和 pH為2.0時標準品的分離度，只有pH為2.0時分離度達到要求，故選用0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈=81∶19(用磷酸調pH為2.0)為本方法的流動相。

綜上所述，采用高效液相色譜法測定土霉素片中土霉素的含量具有簡便、快捷、經濟、準確、重現性好等優點，該法可用于土霉素片的質量控制。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010(二部)［M］.北京:中國醫藥科技出版社.

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［3］高廣慧，李陽，孫曉娟，等.HPLC法測定牛羊肉中土霉素、四環素、金霉素殘留量［J］.食品研究與開發，2013(16):94-96.

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