RP-HPLC-DAD法初步考察5種化合物對照品的穩定性

顧志榮，丁軍霞，王亞麗，孫宇靖

(1.甘肅中醫學院藥學院，甘肅 蘭州 730000;2.甘肅中醫學院 當歸研究所，甘肅 蘭州 730000)

阿魏酸、正丁基苯酞、Z-藁本內酯、正丁烯基苯酞以及亞油酸是中藥分析及植物成分分析中常見的5種化合物［1］。其中，正丁基苯酞、Z-藁本內酯以及正丁烯基苯酞屬內酯類化合物，均為油狀，易通過氧化、水解、光解和異構化等發生結構改變［2］。這些化合物集中分布在傘形科植物中，特別在藁本屬(Ligusticum)植物中幾乎均含有，具有擴血管、鎮痛、解痙、平喘及抗腫瘤等多重作用［3］。阿魏酸是重要的植物酚酸類成分，是植物細胞壁中與多糖和木質素交聯的部分，是當歸、川芎、阿魏、升麻等多種常用中藥的主要有效成分，具有抗氧化、清除自由基以及抗紫外線等作用，廣泛應用于醫藥、保健品、化妝品、農藥和食品添加劑等方面［4］。但阿魏酸在水中穩定性差，見光易分解，易與阿魏酸松柏酯相互轉化［5］。亞油酸是人體無法合成的必須脂肪酸，其不飽和鍵具有降低血清膽固醇的作用［6］，其鋁鹽廣泛用于制造油漆、涂料等，但其在空氣中易發生自氧化。由于這5種化合物常溫下在空氣中均不穩定，因此給標準物質的制備及成分定性定量檢測帶來很大困難。

目前，對這5種化合物穩定性的考察筆者未見報道，本研究采用RP-HPLC-DAD法研究5種對照品的甲醇混合溶液的穩定性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

對照品阿魏酸(中國藥品生物制品檢定所，批號131187-100504);正丁基苯酞(批號342-12-11)及亞油酸(批號245-12-06)來自美國迪瑪公司;正丁烯基苯酞(批號2546-06-4)及Z-藁本內酯(批號2456-03-2)為天津一方科技有限公司產;甲醇，色譜純;超純水(自制，電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

Agilent 1100 LC/DAD系統(G1312A二元梯度洗脫泵;G1315B DAD檢測器;Agilent化學工作站;G1313A進樣器;G1316A柱溫箱);BT1250型電子天平;KQ-500DE超聲波清洗器。

1.2 供試品混合溶液的配制

分別精密稱取阿魏酸、正丁基苯酞、Z-藁本內酯、正丁烯基苯酞、亞油酸對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為420，860，686，1 000，680 μg/mL 的混合對照品溶液。分別精密吸取上述溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

1.3 色譜條件

Waters X-Bridge C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動相為甲醇(B)-水(A)，梯度洗脫條件見表1;體積流量0.8 mL/min，檢測波長:阿魏酸、正丁基苯酞、Z-藁本內酯及正丁烯基苯酞280 nm，亞油酸206 nm。柱溫30℃，進樣體積10μL。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

在1.3節色譜條件下，精密吸取混合供試品甲醇溶液10μL進樣，色譜圖見圖1。

圖1 5種化合物的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 5 chemical compounds

由圖1可知，阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z-藁本內酯、亞油酸的保留時間分別為11.177，21.753，33.718，34.067 min 和 34.396 min，分離度均大于1.5，理論板數(按阿魏酸色譜峰計算)不低于5 000。

2.2 12 h內穩定性考察

精密吸取混合供試品甲醇溶液10μL，按1.3節色譜條件每隔2 h進樣1次，連續進樣6次，結果見表2和圖2。

表2 5種化合物12 h內峰面積的變化Table2 Peak area change of 5 chemical compounds in 12 h

由圖2可知，5種化合物在甲醇溶液中于12 h內均穩定，但色譜圖的基線越來越不平穩。由表2可知，5種化合物在甲醇溶液中于12 h內色譜峰面積基本穩定，RSD均小于2.0%。由此可知，5種對照品混合物的甲醇溶液12 h內穩定性較好，測試時不需新鮮配制。

圖2 5種化合物12 h內的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 5 chemical compounds in 12 h

2.3 4 d內穩定性考察

精密吸取混合供試品甲醇溶液10μL，按1.3節色譜條件每天(白天測定)進樣3次，每次間隔4 h，連續測定4 d(實驗室溫度17.4 ～ 21.8℃，相對濕度55% ～64%)，結果見圖3和表3。

由圖4可知，5種化合物在甲醇溶液中于2 d內及第3 d前8 h內均穩定，但色譜圖的基線隨放置時間的增加越來越不平穩。從第3 d后4個小時開始，混合供試品開始出現分解，分解所得物質的色譜峰分別為a、b及c，至第4 d全面分解，分解所得物質的色譜峰為a～g。化合物分解后的HPLC圖譜雜峰較多，噪聲較大，基線不平穩。

表3 5種化合物4 d內峰面積的變化Table3 Peak area change of 5 chemical compounds in 4 d

由表3可知，正丁烯基苯酞和亞油酸4 d內色譜峰面積基本穩定，RSD均小于3.0%，而阿魏酸、正丁基苯酞以及Z-藁本內酯4 d內色譜峰面積的變化較大，RSD均大于6.0%，且峰面積呈減少趨勢，因此推測4 d內分解的對照品可能為阿魏酸、正丁基苯酞以及Z-藁本內酯，但分解的途徑及產物需要作進一步研究。由上述分析可知，5種對照品混合物的甲醇溶液在2 d內(亦可為56 h內)穩定性較好，不需新鮮配制，超過56 h則需新鮮配制。

1，2，3 d表示當日第2次進樣所得圖譜;3 d(3)表示第3 d第3次進樣所得圖譜;4 d(1)表示第4 d第1次進樣所得圖譜。

圖3 5種化合物4 d內的HPLC色譜圖Fig.3 HPLCchromatograms of 5 chemical compounds in 4 d

2.4 精密度考察

精密吸取混合供試品甲醇溶液10μL，按1.3節色譜條件連續進樣6次，結果阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z-藁本內酯以及亞油酸峰面積的RSD 分別為 0.81%，1.13%，1.39%，0.54%，1.90%;保留時間的 RSD 分別為 0.89%，0.93%，0.73%，1.05%，2.03%。結果表明，該儀器及方法日內運行精密度良好。

3 結論

(1)阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z-藁本內酯以及亞油酸對照品混合物的甲醇溶液于56 h內穩定性較好，不需新鮮配制，超過56 h則需新鮮配制。

(2)對照品混合物從第3 d后4個小時開始出現分解，分解的對照品可能為阿魏酸、正丁基苯酞以及Z-藁本內酯。

［1］ Qian Y Y，Wang Y L，Sa R N，et al.Metabolic fingerprinting of Angelica sinensis during growth using UPLC-TOFMS and chemometrics data analysis［J］.J Chem Centr，2013(7):42-47.

［2］ 魏玉平，劉俊，廖杰，等.GAP基地川芎藥材中苯酞類成分的監測［J］.中國藥學雜志，2004，39(11):817.

［3］ 左愛華，王莉，肖紅斌.洋川芎內酯A和洋川芎內酯I的降解產物研究［J］.中草藥，2012，43(11):2127-2131.

［4］ 鄭妍，朱利民.酚酸類化合物的應用及改性研究新進展［J］.應用化工，2007，36(9):918-921.

［5］ 李韶菁，張迎春，蘇培瑜，等.阿魏酸松柏酯的研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(3):229-231.

［6］ 張春娥，張惠，劉楚怡，等.亞油酸的研究進展［J］.糧油加工，2010(5):18-21.