HPLC —DAD法同時測定清肺抑火片中4個成分的含量

康紹建　何雨芹　張雯潔

摘要：目的建立HPLC法同時測定清肺抑火片中梔子苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚的含量。方法采用Waters C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙睛（A）-0.2%磷酸（B）為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，采用DAD檢測器在200～400 nm波長處進行檢測，柱溫30 ℃。結果調取不同波長的色譜圖分別計算各成分的含量，梔子苷（237 nm）、黃芩苷（277 nm）、大黃素（254 nm）和大黃酚（254 nm）進樣量分別在0.2825～5.650 μg（r2=1）；0.719～14.383 μg（r2=0.9999）；0.0415～0.83 μg（r2=0.9998）；0.0440～0.8795 μg（r2=0.9999）范圍內呈現良好的線性關系。平均回收率（n=6）分別為97.93%，97.89%，97.91%，98.04%；RSD分別為0.14%，0.47%，0.45%，0.21%。結論該方法快速簡便，結果準確可靠，為清肺抑火片的全而質量控制提供科學的依據。

關鍵詞：清肺抑火片；梔子苷；黃芩苷；大黃素；大黃酚；含量測定

中圖分類號：R284文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2014）08-0064-03

清肺抑火片由梔子、黃芩、大黃、天花粉等9味藥組成，具有清肺止嗽，降火生津的功效。用于肺熱咳嗽，痰延壅盛，咽喉腫痛，口鼻生瘡，牙齒疼痛，牙根出血，大便干燥，小便赤黃[1]。全國有22個批準文號，涉及21家生產企業；現行法定標準有7個，其中4個標準的檢驗項目只有性狀和檢查，3個標準增加了3～4個薄層色譜鑒別和黃芩苷含量測定；但其檢測方法和評價指標不一；不能很好的控制產品質量。本文運用HPLC-DAD采用梯度洗脫，調取不同波長的色譜圖同時測定清肺抑火片中梔子、黃芩和大黃的主要有效成分梔子苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚的含量[2～4]，為全面評價清肺抑火片的質量提供了簡便快速、準確可靠的方法。

1儀器與試藥

儀器：waters e2695/2998高效液相色譜儀（waters 2998紫外檢測器，二極管陣列檢測器，Empower pro色譜工作站）；分析天平（Denver TB-215D，十萬分之一）；分析天平（SartorIUS BS224S，萬分之一）。

試藥：清肺抑火片（批號120866、130754 和121294）樣品由云南騰藥制藥有限公司提供；梔子苷對照品（批號110749-201115）、大黃素對照品（批號110756-200110）、大黃酚對照品（批號110796-200514，含量按99.6%計算）、黃芩苷對照品（批號110715-201117，含量按91.7%計算），均由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純，實驗用水為純凈水；其它試劑均為分析純。

2溶液制備

2.1混合對照品溶液分別精密稱取大黃素0.00813 g，大黃酚0.00883 g，置于50 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度為混合對照品溶液①；另精密稱取梔子苷0.01130 g，黃芩苷0.03137 g置于20 mL量瓶中，從①中精密量取10 mL溶液加入其中，加甲醇稀釋至刻度，再從中取5 mL于10 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度即為混合對照品溶液，各對照品濃度分別為：梔子苷0.2825 mg/mL；黃芩苷0.7192 mg/mL；大黃素0.0406 mg/mL；大黃酚0.04397 mg/mL。

2.2供試品溶液取本品10片，精密稱定，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇100 mL，稱定重量，超聲40 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液50 mL，蒸干，殘渣用甲醇轉移至10 mL量瓶中定容，搖勻，濾過，取續濾液即得。

2.3陰性樣品溶液根據處方分別制備缺梔子、黃芩和大黃的樣品，按“2.2”項下方法制備陰性溶液，即得。

3色譜條件

4線性關系的考察

精密稱大黃素0.00830 g，大黃酚0.00883 g，置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻為混對對照品溶液A；另精密稱取梔子苷0.01130 g，黃芩苷0.03137 g于20 mL容量瓶中，從A中精密量取溶液10 mL于其中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，為對照品溶液①；精密量取①5 mL置10 mL量瓶中，稀釋至刻度，為對照品溶液②；精密量取①5 mL置25 mL量瓶中，稀釋至刻度，為對照品溶液③；精密量取①5 mL置50 mL量瓶中，稀釋至刻度，為對照品溶液④；精密量取④5 mL置10 mL量瓶中，稀釋至刻度，為對照品溶液⑤；分別吸取上述各濃度對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量（μg）為橫坐標（X），以測得峰面積為縱坐標（Y），線性回歸，即得4個化合物的回歸方程分別為：梔子苷Y=1E+06 X+19601，r2=1；線性范圍：0.2825～5.650μg。黃芩苷Y=3E+06X-1133.2，r2=0.9999；線性范圍：0.719～14.383μg大黃素Y=3E+06X-4141.8，r2=0.9998；線性范圍：0.0415～0.83μg大黃酚Y=5E+06X+13357，r2=0.9999；線性范圍：0.0440～0.8795μg，結果表明上述各化合物線性關系良好。

5精密度、重復性和穩定性試驗

精密吸取混合對照品溶液②10 μL，連續進樣6次，以峰面積計算，結果梔子苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚的RSD分別為0.40、0.35、0.66、0.18%。結果表明儀器精密度良好。

取同一批號樣品（批號：121294）6 份，按上述“2.2”項下供試品溶液制備方法，平行處理并測定，結果6 次測得各組分中的梔子苷平均含量為3.5228 mg/g，RSD=0.40%；黃芩苷11.9714 mg/g，RSD=0.85%；大黃素0.4308 mg/g，RSD=1.10%；大黃酚0.4860 mg/g，RSD=0.41%，說明重復性良好。

按上述“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫條件下每2h進樣1次，以峰面積計算，梔子苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚的RSD（n=7）分別為0.39、0.69、0.44、0.45%。結果表明室溫條件下，供試品溶液中的4個化合物在12h內穩定。

6加樣回收率試驗

精密稱取已知濃度的供試品（批號：121249）0.5 g，置具塞錐形瓶中，同時取6份，分別精密加入梔子苷濃度為0.1834 mg/mL、黃芩苷濃度為0.5954 mg/mL、大黃素濃0.0324 mg/mL、大黃酚0.0352 mg/mL的混合對照品溶液5 mL，加甲醇95 mL，按上述“2.2”項下方法制備所需溶液，照含量測定方法項下操作，測定供試品溶液中各成分的含量，計算梔子苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚的平均回收率（n=6）分別為：97.93、97.89、97.91、98.04%。RSD 分別為0.14、0.47、0.45、0.21%。

7含量測定

8.1流動相的選擇方面我們曾試過甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸3種系統作為流動相，在前兩種系統下梔子苷拖尾嚴重，黃芩苷分離度達不到要求。而采用乙腈-0.2%磷酸系統，4個主成分峰形對稱、拖尾因子均能達到要求，重現性好。

8.2樣品的處理方面我們采用了3種方法，分別是超聲提取、回流提取、索氏提取，4種主要成分的提取結果顯示超聲提取效果最佳，操作簡便、快捷。

8.3實驗中對市場抽到的15家企業樣品按照上述實驗條件進行檢測，發現各生產企業間產品質量差異大，企業內各批次產品質量差異也較大，分析原因：各企業執行的標準不統一，各標準規定項目及限度不同；各企業生產工藝參數不完全相同；有的企業因標準太低，在生產時未能對各味藥材的質量進行全面控制。提示生產企業應加強對原料質量嚴格把關，以確保產品質量，保證人民群眾用藥的安全與有效。

參考文獻：

[1]衛生部藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑（第二冊）[S].北京：中華人民共和國衛生部，1990：248.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[3]封士蘭、陳立仁、趙富虎，等.高效液相色譜法測定大黃降脂粉中大黃酸、大黃素、丹參酮ⅡA的含量[J].藥物分析雜志，2000，7（20）：367-368.

[4]張玲莉，彭燕，涂毅.高效液相色譜法測定黃芩口服液中黃芩苷的含量[J].中國藥師，2005，8（5）：388-389.

（收稿日期：2014-04-25）

按上述“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫條件下每2h進樣1次，以峰面積計算，梔子苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚的RSD（n=7）分別為0.39、0.69、0.44、0.45%。結果表明室溫條件下，供試品溶液中的4個化合物在12h內穩定。

6加樣回收率試驗

精密稱取已知濃度的供試品（批號：121249）0.5 g，置具塞錐形瓶中，同時取6份，分別精密加入梔子苷濃度為0.1834 mg/mL、黃芩苷濃度為0.5954 mg/mL、大黃素濃0.0324 mg/mL、大黃酚0.0352 mg/mL的混合對照品溶液5 mL，加甲醇95 mL，按上述“2.2”項下方法制備所需溶液，照含量測定方法項下操作，測定供試品溶液中各成分的含量，計算梔子苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚的平均回收率（n=6）分別為：97.93、97.89、97.91、98.04%。RSD 分別為0.14、0.47、0.45、0.21%。

7含量測定

8.1流動相的選擇方面我們曾試過甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸3種系統作為流動相，在前兩種系統下梔子苷拖尾嚴重，黃芩苷分離度達不到要求。而采用乙腈-0.2%磷酸系統，4個主成分峰形對稱、拖尾因子均能達到要求，重現性好。

8.2樣品的處理方面我們采用了3種方法，分別是超聲提取、回流提取、索氏提取，4種主要成分的提取結果顯示超聲提取效果最佳，操作簡便、快捷。

8.3實驗中對市場抽到的15家企業樣品按照上述實驗條件進行檢測，發現各生產企業間產品質量差異大，企業內各批次產品質量差異也較大，分析原因：各企業執行的標準不統一，各標準規定項目及限度不同；各企業生產工藝參數不完全相同；有的企業因標準太低，在生產時未能對各味藥材的質量進行全面控制。提示生產企業應加強對原料質量嚴格把關，以確保產品質量，保證人民群眾用藥的安全與有效。

參考文獻：

[1]衛生部藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑（第二冊）[S].北京：中華人民共和國衛生部，1990：248.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[3]封士蘭、陳立仁、趙富虎，等.高效液相色譜法測定大黃降脂粉中大黃酸、大黃素、丹參酮ⅡA的含量[J].藥物分析雜志，2000，7（20）：367-368.

[4]張玲莉，彭燕，涂毅.高效液相色譜法測定黃芩口服液中黃芩苷的含量[J].中國藥師，2005，8（5）：388-389.

（收稿日期：2014-04-25）

按上述“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫條件下每2h進樣1次，以峰面積計算，梔子苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚的RSD（n=7）分別為0.39、0.69、0.44、0.45%。結果表明室溫條件下，供試品溶液中的4個化合物在12h內穩定。

6加樣回收率試驗

精密稱取已知濃度的供試品（批號：121249）0.5 g，置具塞錐形瓶中，同時取6份，分別精密加入梔子苷濃度為0.1834 mg/mL、黃芩苷濃度為0.5954 mg/mL、大黃素濃0.0324 mg/mL、大黃酚0.0352 mg/mL的混合對照品溶液5 mL，加甲醇95 mL，按上述“2.2”項下方法制備所需溶液，照含量測定方法項下操作，測定供試品溶液中各成分的含量，計算梔子苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚的平均回收率（n=6）分別為：97.93、97.89、97.91、98.04%。RSD 分別為0.14、0.47、0.45、0.21%。

7含量測定

8.1流動相的選擇方面我們曾試過甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸3種系統作為流動相，在前兩種系統下梔子苷拖尾嚴重，黃芩苷分離度達不到要求。而采用乙腈-0.2%磷酸系統，4個主成分峰形對稱、拖尾因子均能達到要求，重現性好。

8.2樣品的處理方面我們采用了3種方法，分別是超聲提取、回流提取、索氏提取，4種主要成分的提取結果顯示超聲提取效果最佳，操作簡便、快捷。

8.3實驗中對市場抽到的15家企業樣品按照上述實驗條件進行檢測，發現各生產企業間產品質量差異大，企業內各批次產品質量差異也較大，分析原因：各企業執行的標準不統一，各標準規定項目及限度不同；各企業生產工藝參數不完全相同；有的企業因標準太低，在生產時未能對各味藥材的質量進行全面控制。提示生產企業應加強對原料質量嚴格把關，以確保產品質量，保證人民群眾用藥的安全與有效。

參考文獻：

[1]衛生部藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑（第二冊）[S].北京：中華人民共和國衛生部，1990：248.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

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[4]張玲莉，彭燕，涂毅.高效液相色譜法測定黃芩口服液中黃芩苷的含量[J].中國藥師，2005，8（5）：388-389.

（收稿日期：2014-04-25）