核黃素和脫乙酰幾丁質對甘薯幾丁質酶的誘導作用

朱劉影+張健+劉倩倩+徐悅+馬媛媛+謝逸萍+劉美艷

摘要：利用甘薯黑斑病菌的孢子懸液誘導甘薯塊根幾丁質酶活性。結果表明，黑斑病浸染使甘薯塊根幾丁質酶活性上升，抗病品種南京-92塊根內幾丁質酶活性比感病品種煙臺-252提高速度快、活性高、保持時間長，有利于抵抗病原菌的侵害。體外抑菌試驗顯示幾丁質酶液對甘薯黑斑病菌具有較強的抑制作用。核黃素和脫乙酰幾丁質處理均能誘導甘薯塊根幾丁質酶活性提高。

關鍵詞：甘薯；黑斑病；幾丁質酶；核黃素；脫乙酰幾丁質

中圖分類號：S435.313+.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0106-03

甘薯（Ipomoea batatas）是僅次于水稻、小麥和玉米的重要糧食作物，甘薯葉被世界衛生組織確定為最佳蔬菜^[1]。甘薯產乙醇能效高、無污染，是生物能源的理想材料之一。甘薯黑斑病（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）是危害甘薯的主要病害，在甘薯的種植和儲藏過程中均有發生^[2]。目前對于甘薯抗黑斑病的研究多集中在篩選抗病品種和雜交育種方面^[3]，對于甘薯抗黑斑病機制方面的報道很少^[4-5]，研究也不深入。植物病程相關蛋白（pathogenesis-related protein，PRs）是植物體內被病原菌等刺激物刺激產生的一類蛋白質，正常情況下含量并不高，一旦被誘導，含量迅速增加，從而提高植物對病蟲害等逆境的防御能力^[6]。植物幾丁質酶被認為是一類與植物抗病有著密切關系的病程相關蛋白。它參與了植物體內防御機制^[7-8]，在外界刺激物的刺激下可使植物體內本身含量較少的酶迅速積累。誘導物分為兩大類，一類為生物性的刺激物，包括細菌、真菌、病毒類或者真菌細胞壁降解物^[9-10]，另一類為非生物性的刺激物，包括機械損傷、蟲傷、脫乙酰幾丁質、乙烯、水楊酸、紫外光、重金屬鹽等。通過誘導物來誘導甘薯幾丁質酶含量上升和活性提高的研究未見報道。本試驗研究了核黃素和脫乙酰幾丁質對甘薯塊根幾丁質酶誘導作用，旨在為生產上防治甘薯黑斑病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘薯品種為南京-92（高抗黑斑病）和煙臺-252（高感黑斑病），甘薯黑斑病病原物，均由中國農科院甘薯研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 黑斑病菌孢子懸液的制備 黑斑病菌孢子懸液的制備按照王景景等的方法^[4]進行。

1.2.2 薯塊接種 選取兩個品種正常無病斑的薯塊，用自來水沖洗干凈，再放入0.1%的次氯酸鈉溶液中，表面消毒 10 min，用蒸餾水沖洗3次。將塊根切成約1.0 cm厚的圓片，將0.1 mL黑斑病菌內分生孢子懸液涂在塊根圓片的表面，放置于28 ℃恒溫箱中培養，以蒸餾水涂抹塊根圓片的作為對照組。

1.2.3 幾丁質酶的提取和活性測定 分別取兩個品種染菌后的甘薯塊根各0.5 g，加4 mL 0.02 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5），冰浴研磨，定容至5 mL，4 ℃ 8 000 r/mi，離心15 min，上清液為待測酶液。幾丁質酶活力測定參照Boller等方法^[11]進行。酶活定義：以每小時分解膠體幾丁質產生 1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

1.2.4 甘薯幾丁質酶體外抑菌試驗

采用瓊脂擴散法來檢測甘薯幾丁質酶體外抑菌的效果^[12]。PDA培養基冷卻后，用滅菌后直徑 7 mm的打孔器在平板上均勻打出6個孔洞。用無菌牙簽挑出瓊脂柱。在每個孔中加入少量未凝固的PDA封住孔底部，約2 mm厚度。然后將20 μL無菌酶液以及稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 的酶液分別加入孔中，最后用新的滅菌后的打孔器在活化好的待試菌種培養基上打一個菌餅，將其倒貼于加過菌液的培養基正中央，28 ℃培養箱中倒置培養4 d。通過比較病斑大小來判定幾丁質酶的抑菌效果。檢測對象為甘薯黑斑病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌。

1.2.5 核黃素和脫乙酰幾丁質處理

脫乙酰幾丁質原液的制備按王榮娟^[13]的方法進行。

將3 mL核黃素（1 mmol/L）和脫乙酰幾丁質（1 mg/mL）均勻涂抹在薯塊的表面，然后將薯塊放入培養皿中，30±1 ℃暗箱中保溫。試驗各處理均設3次重復。數據采用SPSS Statistics軟件進行統計分析。P<0.05（用*表示）為顯著性差異，P<0.01（用**表示）為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 黑斑病侵染對不同抗性甘薯塊根幾丁質酶活性的影響

黑斑病對2種不同抗性甘薯塊根內幾丁質酶活性的影響見圖1。從圖1可以看出，未接種黑斑病菌時，南京-92和煙臺-252塊根中幾丁質酶活性差異不顯著。接菌后2個品種幾丁質酶活性上升，于接菌后6 d達到最大值，而高抗品種南京-92塊根幾丁質酶活性增加速度高于高感品種煙臺-252。差異分析表明，染菌4 d和8 d時南京-92塊根幾丁質酶活性顯著高于煙臺-252，2 d和6 d時兩甘薯品種幾丁質酶活性差異極顯著。

2.2 甘薯幾丁質酶對3種真菌的抑制作用

檢測了甘薯幾丁質酶對甘薯黑斑病菌、小麥赤霉病菌和水稻紋枯病菌的抑制作用（圖2）。通過比較抑菌圈的大小可以看出：甘薯幾丁質酶液（100）和稀釋成10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5 的酶液對甘薯黑斑病菌（圖2-A）有較明顯的抑制作用，對小麥赤霉病菌（圖2-B）和水稻紋枯病菌（圖2-C）的抑制作用較小。

2.3 核黃素對不同抗性甘薯幾丁質酶活性的影響

經核黃素處理后，2種不同抗性甘薯塊中幾丁質酶活性均呈現升高的趨勢（圖3）。高抗品種南京-92幾丁質酶活性的上升幅度比高感品種煙臺-252大，且在整個處理期間南京-92幾丁質酶活性高于煙臺-252。處理4 d和6 d時，南京-92幾丁質酶活性是煙臺-252的213.9%和175%。顯著性分析表明，處理2 d和8 d時2個甘薯品種幾丁質酶活性差異顯著；處理4 d和6 d時2個甘薯品種幾丁質酶活性差異極顯著。

2.4 脫乙酰幾丁質對不同抗性甘薯幾丁質酶活性的影響

脫乙酰幾丁質能提高甘薯幾丁質酶的活性（圖4）。比較2個抗性不同甘薯品種幾丁質酶活性的變化可以看出，南京-92幾丁質酶活性的上升速度快且活性高于高感品種煙臺臺-252的221.9%和158.9%。顯著性分析表明，處理2 d時2個甘薯品種幾丁質酶活性差異顯著；處理4 d、6 d和8 d時2個甘薯品種幾丁質酶活性差異極顯著。

3 討論

幾丁質是真菌細胞壁的主要成分，幾丁質酶的底物為幾丁質，因此植物幾丁質酶能夠直接降解真菌細胞壁，抑制真菌孢子萌發和菌絲生長，從而達到抑制真菌病害的作用^[14]。本試驗結果驗證了甘薯幾丁質酶是一種誘導酶^[15-16]。未感染黑斑病時，高抗和高感薯塊內幾丁質酶活性都很低，并且差異不顯著；受黑斑病菌感染后，兩個品種薯塊能夠迅速積累幾丁質酶來水解黑斑病菌的細胞壁，抑制菌絲的生長，高抗品種甘薯塊內的幾丁質酶比高感品種積累的量多，幾丁質酶活性在處理 2 d 和6 d時達到極顯著差異，說明幾丁質酶對于甘薯抵抗黑斑病的侵染具有重要作用。抑菌試驗進一步證明了甘薯幾丁質酶對甘薯黑斑病有較強的抑制作用。

幾丁質酶是重要的病程相關蛋白，能夠分解β-1，4鍵形成的線性幾丁質，幾丁質酶活性能夠在抗性誘導過程中顯著增強^[17]。研究表明，核黃素作為非專化激發子可以誘導植物產生系統獲得抗病性^[18]。脫乙酰幾丁質主要存在于海洋生物、昆蟲的甲殼中，研究表明，脫乙酰幾丁質能誘導植物提高抗病性[13，19]。本研究結果表明，核黃素和脫乙酰幾丁質處理能提高甘薯塊根幾丁質酶活性，高抗品種酶活性高于高感品種，幾丁質酶活性的上升有助于提高甘薯對黑斑病的抵抗能力。這與以玉米、番茄、蘋果為試驗材料的結果一致^[20-21]。本研究結果為生產上防治甘薯黑斑病提供了一種可行的方法。

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