富硒枸杞子對臨床常見分離耐藥菌體外抑菌活性的研究＊

馬 銳，楊風琴，劉俊文，萬巧鳳（．寧夏醫(yī)科大學高等衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，寧夏銀川 750004；．寧夏醫(yī)科大學檢驗學院，寧夏銀川 750004）

目前，國內(nèi)外科研機構(gòu)競相開展了關(guān)于枸杞化學成分分析、藥理學、免疫學、抗疲勞、抗腫瘤等基礎(chǔ)方面的研究［1－6］，為枸杞的開發(fā)利用提供了理論支持。盡管我國對寧夏枸杞進行了大量的研究，但對枸杞的臨床耐藥菌抗菌機制研究尚鮮見報道。本文以枸杞子為原料，制備不同濃度浸出液，研究其對6種常見臨床分離耐藥菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、克柔假絲酵母菌、白色念珠菌）的體外抑菌作用，并測定其最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），分析抑菌圈直徑；并根據(jù)結(jié)果繪制出銅綠假單胞菌在提取液中的生長曲線，旨在更好地體現(xiàn)枸杞子的藥用價值，同時也為枸杞子的全面開發(fā)、利用提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料來源

1．1．1 枸杞子 富硒枸杞子是寧夏南梁農(nóng)場科技人員采用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)培養(yǎng)的富含有機硒與超氧化物歧化酶（SOD）活性的全天然營養(yǎng)性枸杞果實。

1．1．2 實驗菌株 金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌和克柔假絲酵母菌均由寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學實驗中心提供。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 實驗儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP－9162），杭州匯爾實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；生物安全柜BHC－1300ⅡA／B3，武漢愛斯佩科學儀器有限公司生產(chǎn)；全自動高壓蒸汽滅菌器（YQXLS50A），青島海億特機電科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；電子天平（AL－203），上海精科天美儀器有限公司生產(chǎn)。

1．2．2 實驗試劑 1 000μL加樣器、10～50μL加樣器、加樣器槍頭、無菌試管、直徑75mm無菌培養(yǎng)皿。95%乙醇、無菌生理鹽水均購自上海艾測電子專業(yè)銷售有限公司。

1．3 研究方法

1．3．1 枸杞子浸出液的制備方法 稱取全天然營養(yǎng)性枸杞果實100g，加水500mL，溫度18～20℃，浸泡24h，文火煮沸0．5h后過濾。再將其沉渣加水400mL浸泡4h，煮沸0．5h后用細菌過濾器過濾。然后將兩次的過濾液，混合加熱濃縮至100mL，即為100%原液，其濃度相當于生藥量1g／mL，－80℃保存。實驗中再分別用蒸餾水稀釋成0．75、0．50、0．25g／mL，同時，以蒸餾水作為空白對照組。

1．3．2 培養(yǎng)基的配制 水解酪蛋白液體培養(yǎng)基（批號OWDM0202）、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（批號20120726）、沙保羅氏固體培養(yǎng)基（批號20120921），上海江萊生物制品有限公司生產(chǎn)，使用時按使用說明配制。

1．3．3 菌懸液的配制 挑取冷凍菌種適量，接種于普通肉湯培養(yǎng)基試管中，28℃培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑取菌液在瓊脂平板上劃線，培養(yǎng)24h，挑取單個菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)16～18h。取出后用比濁儀測定菌液濃度，用無菌水制成含菌量混濁度為0．5McFarland（比濁標準為108CFU／mL），再將其稀釋至107CFU／mL備用。

1．3．4 微量稀釋法進行MIC的測定 將全天然營養(yǎng)性枸杞果實原液用無菌蒸餾水溶解，配制為1g／mL藥液，用水解酪蛋白雙料液體培養(yǎng)基從第1管進行倍比稀釋至第7管，稀釋倍數(shù)分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，各管對應(yīng)的藥物濃度分別是0．500、0．250、0．125g／mL。每管加相應(yīng)受試標準菌液各50μL，充分混勻，放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。再從每一管中取培養(yǎng)物10μL，轉(zhuǎn)種到水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、沙保羅氏固體培養(yǎng)基上，用L棒涂布，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，以不生長菌落的最高藥物稀釋度為該藥物對該種細菌的MIC。做3次，取其平均值并記錄實驗結(jié)果。

1．3．5 MBC的測定 吸取全天然營養(yǎng)性枸杞不同濃度浸出液的MIC和高于MIC濃度的各個梯度的試管中的培養(yǎng)物0．1 mL，轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃下培養(yǎng)18～24d后觀察有無菌落形成，無菌落形成的相應(yīng)試管中的最低藥物濃度即為該濃度浸出液對供試菌的MBC。

1．3．6 瓊脂擴散法 用無菌棉簽蘸取菌液在普通瓊脂平板上作均勻密集劃線，待菌液干燥后，用外徑5mm的打孔器打孔，每孔加藥液200μL，平放在37℃溫箱中培養(yǎng)24h觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑取3次實驗結(jié)果的平均值。

1．3．7 設(shè)立對照 陰性對照：培養(yǎng)基不加菌；陽性對照：培養(yǎng)基加相應(yīng)的菌。

1．3．8 銅綠假單胞菌生長曲線的繪制 將銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按2%的接種量加入到含0．25g／mL全天然營養(yǎng)性枸杞子的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，放入37℃、120r／min搖床培養(yǎng)，在0～52h中每4h取樣一次，用可見分光光度計在波長為580nm下測定其吸光度值（A值），加入等量無水乙醇為對照組，實驗重復3次，取平均值。繪制枸杞子作用于銅綠假單胞菌的生長曲線。

2 結(jié) 果

2．1 枸杞子浸出液對6種臨床常見細菌的MIC和MBC 不同濃度的枸杞子浸出液對耐藥菌均有一定程度抑菌效果，但對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的抑菌作用強；對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抑菌作用一般；而對克柔假絲酵母菌和白色念珠菌的相對較弱。結(jié)果見表1。

表1 枸杞子浸出液對6種臨床常見細菌的MIC和MBC

2．2 不同濃度枸杞子浸出液對6種臨床常見細菌的抑菌圈直徑比較 采用稀釋法對4種不同濃度枸杞子浸出液測定金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、克柔假絲酵母菌、白假絲酵母菌、銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑，隨著濃度的增加，6種細菌的抑菌圈直徑增加，其中銅綠假單胞菌的增加最明顯而且抑菌圈直徑最大；而白假絲酵母菌和克柔假絲酵母菌在不同濃度下，抑菌圈直徑增加不明顯。結(jié)果見表2。

表2 不同濃度枸杞子浸出液對6種臨床常見細菌的抑菌圈直徑（±s，mm）

表2 不同濃度枸杞子浸出液對6種臨床常見細菌的抑菌圈直徑（±s，mm）

注：與0．25g／mL濃度比較，aP＜0．05；b P＜0．01。

組別 金黃色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 大腸埃希菌 銅綠假單胞菌 白假絲酵母菌 克柔假絲酵母菌空白對照000000枸杞子浸出液（g／mL）0．25 20．82±0．37 20．76±0．41 22．78±0．31 23．07±0．45 16．77±0．41 15．98±0．54 0．50 21．91±0．19 21．81±0．14 23．80±0．29a 24．16±0．49a 17．56±0．29 16．36±0．48 0．75 23．57±0．40a 23．39±0．44a 27．57±0．47b 29．34±0．39b 18．97±0．34 16．97±0．34 1．00 26．48±0．45b 26．36±0．39b 30．89±0．51b 35．16±0．34b 19．16±0．23a 17．86±0．44a

2．3 枸杞子對銅綠假單胞菌生長曲線的影響 寧夏全天然營養(yǎng)性枸杞子浸出液對銅綠假單胞菌生長曲線的影響結(jié)果見圖1。由圖可知，枸杞子組中的銅綠假單胞菌在對數(shù)生長期明顯被抑制，8h的抑制率最高為77．41%。24h時細菌濃度最高，但A值為2．245，比對照組小4%，隨即二者均進入衰亡期，從圖中可以看出，在28h之前，枸杞子提取物嚴重地抑制了銅綠假單胞菌的生長。

圖1 枸杞子對銅綠假單胞菌生長曲線的影響

3 討 論

伴隨分子生物學、生物化學和免疫學新技術(shù)的發(fā)展，許多研究者對于祖國傳統(tǒng)中醫(yī)中藥的研發(fā)力度在逐步加強。寧夏回族自治區(qū)中寧縣是全國枸杞的最好產(chǎn)地，寧夏地區(qū)食物中的含硒量極低，而通過生物技術(shù)培育的富硒枸杞，其抗氧化清除自由基的作用得到了強化［7－8］。本研究初篩的枸杞抗菌活性物質(zhì)是未知成分，其生物學性狀未知，只能根據(jù)相關(guān)研究資料來設(shè)計實驗方案。預(yù)期經(jīng)過一步步實驗得到比較理想的抗菌肽活性物質(zhì)，為枸杞抗菌肽藥效、藥理學和抑菌機制的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

近年來，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株逐年增多，據(jù)統(tǒng)計對青霉素G耐藥的金黃色葡萄球菌已達90%以上，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）已成為醫(yī)院內(nèi)感染最常見的致病菌［9－11］。本文通過測定不同枸杞子浸出液對耐藥菌的MIC、MBC和測量抑菌圈直徑發(fā)現(xiàn)，不同枸杞子浸出液對耐藥菌均有一定程度抑菌效果，其中對銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的抑菌作用強，而對葡萄球菌的抑菌作用一般，對白色假絲酵母菌和克柔假絲酵母菌的抑菌作用相對較弱。初步分析，由于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌細胞壁成分、結(jié)構(gòu)不同，枸杞子對于革蘭陰性菌的抑制作用明顯好于革蘭陽性菌［12］，這對臨床治療選擇合適的抗生素帶來了便利。

在醫(yī)源性感染中由銅綠假單胞菌引起者占10%左右，在某些特殊病房中，如燒傷和腫瘤病房、各種導管和內(nèi)鏡的治療與檢查室內(nèi)，銅綠假單胞菌的感染率可高達30%。同時，銅綠假單胞菌對許多抗生素具有天然或獲得性耐藥性，甚至多重耐藥，給臨床治療帶來極大困難。而本研究通過測量MIC、MBC和抑菌圈直徑發(fā)現(xiàn)枸杞子浸出液對銅綠假單胞菌的抑菌作用強，故繪制出銅綠假單胞菌在提取液中的生長曲線，希望能為研究枸杞子作為抗銅綠假單胞菌新藥提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。同時，充分利用枸杞資源，獲得抗菌活性成分，有利于寧夏枸杞的生產(chǎn)，進而有利于發(fā)展本地經(jīng)濟，增加產(chǎn)區(qū)人們的經(jīng)濟收入，同時減少抗生素的大量使用，保護環(huán)境。

［1］ Sze SC，Song JX，Wong RN，et al．Application of SCAR（sequence characterized amplified region）analysis to authenticate Lycium barbarum（wolfberry）and its adulterants［J］．Biotechnol Appl Biochem，2008，51（1）：15－21．

［2］ 黃泰康．現(xiàn)代本草綱目［M］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001：1891．

［3］ Woodford N，Ellington MJ．The emergence of antibiotic resistance by mutation［J］．Clin Microbiol Infect，2007，13（1）：5－18．

［4］ Chen Z，Kwong Huat Tan B，Chan SH．Activation of T lymphocytes by polysaccharide－protein complex from Lycium barbarum L［J］．Int Immunopharmacol，2008，8（12）：1663－1671．

［5］ Oppenheim JJ，Biragyn A，Kwak LW，et al．Roles of antimicrobial peptides such as defensins in innate and adaptive immunity［J］．Ann Rheum Dis，2003，62（Suppl 2）：ii17－ii21．

［6］ Chang RC，So KF．Use of Anti－aging Herbal Medicine，Lycium barbarum，Against Aging－associated Diseases．What Do We Know So Far［J］．Cell Mol Neurobiol，2008，28（5）：643－652．

［7］ Chen R，Moriya J，Yamakawa J，et al．Traditional Chinese medicine for chronic fatigue syndrome［J］．Evid Based Complement Alternat Med，2010，7（1）：3－10．

［8］ 鄭英麗，周子君．抗生素濫用的根源、危害及合理使用的策略［J］．醫(yī)院管理論壇，2007，24（1）：23－27．

［9］Stefani S．WS01basic mechanisms of resistance to antibiotics［J］．J Vet Pharmacol Ther，2006，29（1）：23－26．

［10］劉暢，樊明文．針對細菌感染的治療性疫苗研究進展［J］．中國生物制品學雜志，2008，21（5）：445－448．

［11］陳彤彤，宋曉妍，解樹濤，等．植物源抗菌肽的研究進展［J］．西北植物學報，2006，26（2）：420－426．

［12］Leung AY．Traditional toxicity documentation of Chinese Materia Medica－an overview［J］．Toxicol Pathol，2006，34（4）：319－326．