三氧化二砷對支氣管哮喘小鼠Th17細胞的影響

張 莉，范賢明，王文軍，李 坑，向旭東

（1.瀘州醫學院附屬醫院呼吸內二科，四川 瀘州 646000）；2.中南大學湘雅二醫院急診科，湖南 長沙 410011）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種與免疫功能紊亂有關的慢性氣道炎癥性疾病，其中T細胞發揮著重要作用［1］。Th17細胞是一類新的T細胞亞群，主要通過分泌IL－17起作用。Th17／IL－17參與了多種炎癥與自身免疫性疾病［2］。近期研究發現，Th17／IL－17可能在哮喘的發生發展中扮演著重要角色［3，4］。中醫實踐表明，三氧化二砷（Arsenic trioxide，ATO）具有良好的平喘作用，但機制不清楚，且關于ATO對哮喘Th17／IL－17的作用亦未見報道。本研究通過建立哮喘小鼠模型，觀察ATO對哮喘小鼠的作用，尤其是對Th17細胞和IL－17的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 卵白蛋白（OVA，V級）、氫氧化鋁凝膠、ATO（美國Sigma公司）；淋巴細胞分離液（中國達科為生物技術有限公司）；T細胞磁珠分離試劑盒、LS分離柱、Midi MACS磁珠分選器（德國 Milte－nyi公司）；FITC抗鼠IL－17A、固定劑、破膜劑（美國Biolegend公 司）；IL－4、IL－17ELISA 試 劑 盒 （美 國R＆D公司）。

1.2 動物分組及模型復制 30只SPF級雌性BALB／c小鼠，6～8周齡，體重（18～22）g，隨機分為對照組、哮喘組、ATO組，每組10只。哮喘組及ATO組于第1、13天腹腔注射致敏劑0.2ml（含OVA 10 μg和氫氧化鋁凝膠2mg），19天起以5%OVA霧化激發，每天30min，連續6天。ATO組每次激發前30 min腹腔注射2.5mg／kg ATO 0.2ml，哮喘組以等量PBS代替。對照組致敏激發用PBS代替。

1.3 小鼠處理及標本制備 末次激發24小時后，Buxco系統測量氣道對乙酰甲膽堿（Mch）的肺阻力。收集左肺支氣管肺泡灌洗液（BALF），細胞瑞士染色后分類計數。碾磨脾臟，淋巴細胞分離液制備脾單個核細胞懸液，免疫磁珠陽性分選T細胞。

1.6 ELISA檢測細胞因子濃度 BALF及培養上清液中IL－17、IL－4測定采用ELISA法，參照試劑盒說明操作。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件，數據以表示，采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗。簡單直線相關性分析探討兩因素之間相關關系。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BALF中細胞計數及分類 與對照組相比，哮喘組BALF中白細胞總數、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞顯著增加（均P＜0.01）；與哮喘組相比，ATO組上述細胞數顯著減少（均P＜0.05），見表1。

2.2 肺阻力檢測 與對照組相比，哮喘組隨著 Mch劑量遞增表現出更顯著的氣道阻力；ATO組氣道阻力顯著低于哮喘組，見圖1。

表1 各組BALF中白細胞總數和分類計數（×104／ml，n＝6，）Table 1 Classification and counting of white blood cell in BALF

表1 各組BALF中白細胞總數和分類計數（×104／ml，n＝6，）Table 1 Classification and counting of white blood cell in BALF

注：與對照組比較，①P＜0.01；與哮喘組比較，②P＜0.05

組別 細胞總數 嗜酸性粒細胞 淋巴細胞 中性粒細胞對照組 6.95±1.220.15±0.060.36±0.190.23±0.09哮喘組 21.11±3.28① 3.10±0.50① 6.60±0.97① 4.92±0.45①ATO組 13.04±2.58② 1.06±0.19② 2.43±0.28② 2.36±0.29②

圖1 各組氣道肺阻力比較Figure 1 Comparison of lung resistance in each group

2.3 Th17細胞陽性率比較 哮喘組脾臟Th17細胞陽性率［（12.2±2.2）%］顯著高于對照組［（1.4±0.4）%，P＜0.01］；ATO組Th17細胞陽性率［（8.9±1.2）%］顯著低于哮喘組（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組脾臟Th17細胞陽性率比較Figure 2 Comparison of positive rate of Th17cells

表2 各組脾臟T細胞總數及BALF相關指標比較（n＝6，）Table 2 and IL－17and IL－4in BALF

表2 各組脾臟T細胞總數及BALF相關指標比較（n＝6，）Table 2 and IL－17and IL－4in BALF

注：與對照組比較，①P＜0.05；與哮喘組比較，②P＜0.05

組別 CD4＋T細胞（×108／L） IL－17（pg／ml） IL－4（pg／ml）對照組 6.9±0.8 97.6± 7.6 185.6±21.5哮喘組 17.9±2.1① 169.5± 8.3① 323.5±16.9①ATO組 12.9±2.3② 113.9±11.0② 248.3±19.0②

2.5 培養上清液中IL－17、IL－4濃度 ATO 干預組培養上清液中IL－17、IL－4濃度［分別為（7.9±1.5）、（42.7±5.0）pg／ml］均顯著低于哮喘原液組［分別為（15.3±2.4）、（71.6±7.0）pg／ml，均P＜0.01］。

2.6 相關性分析 Th17細胞陽性率與BALF中性粒細胞數量呈顯著正相關（r＝0.998，P＜0.05），BLAF中IL－17濃度與中性粒細胞數呈顯著正相關（r＝0.982，P＜0.05）。

3 討論

經典的“Th1／Th2失衡理論”并不能解釋哮喘的全部：過繼回輸Th1細胞可以引起嚴重的氣道炎癥，Th1型細胞因子IFN－γ與抗原誘導的氣道高反應性和嗜酸粒細胞浸潤有關。近期支氣管黏膜活檢發現，重癥哮喘患者氣道Th17細胞數量及其分泌IL－17的功能明顯增加［3］。Th17／IL－17對中性粒細胞具有強大的趨化作用，可導致氣道局部炎癥擴大或持久存在，介導激素抵抗型哮喘的氣道炎癥和高反應性［4］。Th17、IL－17是介導哮喘免疫源性氣道炎癥的重要原因［5］。

既往研究認為，小劑量ATO能促進嗜酸粒細胞凋亡、抑制NF－κB表達；能抑制骨髓嗜酸性粒細胞生成，降低血清和BALF中IL－5水平。但是關于ATO對哮喘T細胞，尤其是Th17、IL－17的研究未見報道。Th17細胞能通過IL－17介導氣道中性粒細胞聚集，并可誘導Th2細胞介導的嗜酸性粒細胞炎癥［6］。可見與嗜酸性粒細胞相比，Th17細胞處于炎癥反應上游，對其進行探討更有意義。本實驗中，ATO干預組小鼠BALF中各類炎癥細胞及氣道肺阻力顯著低于哮喘組，提示ATO能減輕氣道炎癥及高反應性。Th2細胞主要通過分泌IL－4等Th2型因子誘導嗜酸性粒細胞浸潤參與哮喘發病［5］。我們發現，ATO組BALF中嗜酸性粒細胞數量及IL－4含量均較哮喘組明顯下降；體外實驗同樣顯示T細胞在ATO干預后分泌IL－4顯著減少，提示ATO能夠抑制Th2細胞的功能，減輕氣道嗜酸性粒細胞性炎癥。

部分哮喘患者對糖皮質激素治療不敏感與氣道中性粒細胞性炎癥有關，因為糖皮質激素可對抗中性粒細胞凋亡［7］。本研究提示ATO能減輕氣道中性粒細胞性炎癥反應。ATO組Th17細胞陽性率、BLAF中IL－17含量均較哮喘組下降，體外實驗也證實ATO能抑制T細胞分泌IL－17，提示ATO能抑制Th17、IL－17的表達。Th17／IL－17是介導哮喘氣道中性粒細胞性炎癥的重要原因［5］。相關性分析發現，Th17細胞陽性率、IL－17水平均與BALF中性粒細胞數量呈顯著正相關，故我們推測ATO對哮喘的治療作用除降低Th2效應外，還可能與減少Th17、IL－17產生，從而抑制中性粒細胞介導的氣道炎癥及高反應性有關。

4 結論

ATO能夠抑制Th17及IL－17的表達，減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應及高反應性。ATO可能對治療糖皮質激素不敏感的中性粒細胞性哮喘有潛在價值。

［2］Xie Y，Chen R，Zhang X，et al.Blockade of interleukin－17Aprotects against coxsackievirus B3－induced myocarditis by increasing COX－2／PGE2production in the heart［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2012，64：343－351.

［3］Pène j，Chevalier S，Preisser L，et al.Chronically inflamed human tissues are infiltrated by highly differentiated Th17lymphocytes［J］.J Immunol，2008，180：7423－7430.

［4］Vazquez－Tello A，Halwani R，Hamid Q，et al.Glucocorticoid receptor－beta up－regulation and steroid resistance induction by IL－17and IL－23cytokine stimulation in peripheral mononuclear cells［J］.J Clin Immunol，2013，33：466－478.

［5］Cosmi L，Liotta F，Maggi E，et al.Th17cells：new players in asthma pathogenesis［J］.Allergy，2011，66：989－998.

［6］Wakashin H，Hirose K，Maezawa Y，et al.IL－23and Th17cells enhance Th2－cell－mediated eosinophilic airway inflammation in mice［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，178：1023－1032.

［7］Zijlstra GJ，Ten Hacken NH，Hoffmann RF，et al.Interleukin－17Ainduces glucocorticoid insensitivity in human bronchial epithelial cells［J］.Eur Respir J，2012，39：439－445.