冠心平對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化氧化與抗氧化指標的影響

戴海云，李七一，嚴士海

(1.南京中醫藥大學，江蘇南京 210000;2.江蘇省中醫院，江蘇南京 210029)

動脈粥樣硬化 (Atherosclerosis，AS)導致的心肌梗死、腦梗死以及冠心病等心腦血管疾病，在目前人類病死原因中占首位。機體過氧化損傷是動脈粥樣硬化發生發展的重要因素之一。南京中醫藥大學附屬江蘇省中醫院李七一教授臨床采用益氣養陰、活血化痰法治療冠心病心絞痛收到較好效果［1］。此后根據益氣養陰、活血化痰法自擬了冠心平方應用于臨床。在前期臨床及實驗研究中提示冠心平能調節血脂水平、保護血管內皮、改善心肌缺血，體外實驗證明冠心平含藥血清能減少細胞上清液中ET、MDA的水平，增加超氧化物歧化酶 (SOD)與一氧化氮合酶 (NOS)的活性，減低細胞凋亡率，減輕細胞線粒體膜電位的增加，降低NF-κB的表達增加［2］。本實驗在前期研究基礎上，觀察了冠心平對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型血清氧化應激與抗氧化指標超氧化物歧化酶 (SOD)、總抗氧化能力 (AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽 (GSH)、氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL)水平的影響，以進一步探討該方作用機制。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 冠心平，由江蘇省中醫院藥劑科制備(批號110802);阿托伐他汀鈣片，由輝瑞制藥有限公司提供 (批號:084311K);苯磺酸氨氯地平，由輝瑞制藥有限公司提供 (批號1105113)。血清T-SOD測定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號20120530);血清GSH測定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號20120611);血清測定MDA試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號20120529);血清T-AOC測定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號20120607)。

1.2 實驗動物 ApoE-/-小鼠，體質量 (20±2)g，雄性，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，合格證號:SCXK(京)2006-0008。

1.3 分組 小鼠適應性飼養后，稱定質量，根據體質量隨機分組編號。將60只ApoE-/-小鼠隨機分成6組，每組10只，分別為空白組 (普通飼料)、模型組 (高脂飼料)、阿托伐他汀組 (6.67 mg/kg)、苯磺酸氨氯地平組 (1.67 mg/kg)、冠心平低劑量組 (0.75 g/kg)、冠心平高劑量組(1.5 g/kg)。各劑量組采用高脂飼料+藥物干預模式。

1.4 動物模型的建立 購買ApoE-/-小鼠，高脂飼料配料(78%基礎飼料、2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油配制)喂養12周，采血并做病理以確定模型成功。

1.5 實驗方法 正常組為基礎飼料喂養，其余組為高脂飼料飼養。除正常組與模型組外，冠心平低劑量組、冠心平高劑量組、阿托伐他汀組、苯磺酸氨氯地平組均高脂飼料喂養12周后，給予相應的藥物，正常對照組、模型組則于12周后給予等量蒸餾水灌胃。冠心平高低劑量組與阿托伐他汀組、苯磺酸氨氯地平組分別將藥物溶解于蒸餾水中灌胃，灌胃容積量按0.1 mL/10 g計算，每日1次，共1周。每周稱體質量1次，記錄體質量，末次給藥1 h后，眼眶采血，檢測相應指標。處死動物，取主動脈血管，液氮保存，備檢測。

1.6 觀測指標及測定方法

1.6.1 分光光度法與elisa法檢測血清中氧化性指標MDA等，抗氧化性指標SOD、AOC、GSH的水平，具體根據試劑說明書操作。

1.6.2 ox-LDL的檢測 提取血管組織蛋白，蛋白樣品處理后進行電泳，轉膜，染色，封閉，一抗二抗孵育，加發光液，曝光。保存顯示有目的條帶的膠片，以β-actin為內參照，應用圖象分析儀對條帶做掃描半定量。

1.7 數據統計 應用SPSS 15.0軟件包，資料數據均用均數±標準差 ()表示，數據先進行方差齊性檢驗，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義，P＜0.01為差異有非常顯著性意義;定量分析主動脈粥樣硬化斑塊面積，使用的Image-Pro Plus軟件4.5(Media Cybernetics公司)。

2 實驗結果

2.1 冠心平對模型 3個月小鼠血清 T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的影響 模型組小鼠血清 T-SOD、T-AOC、GSH的水平明顯降低，與正常組比較具有顯著性差異(P﹤0.01)。模型組小鼠血清MDA、ox-LDL的水平明顯升高，與正常組比較具有顯著性差異 (P﹤0.01)。冠心平低劑量與高劑量組小鼠血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平比模型組明顯升高，與模型組比較具有顯著性差異 (P﹤0.05，P﹤0.01)。冠心平低劑量與高劑量組大鼠血清MDA、ox-LDL的水平比模型組明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異 (P﹤0.01)。提示:冠心平具有升高ApoE-/-小鼠血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平，降低血清MDA、ox-LDL水平的作用。見表1～2。

表1 各組3個月小鼠血清T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的水平 (，n=10)

表1 各組3個月小鼠血清T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的水平 (，n=10)

注:與正常組比較，△△P﹤0.01;與模型組比較，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01

組 別 T-SOD/(U·mL－1) T-AOC/(U·mL－1) MDA/(nmol·mL－1) GSH/(mg·L－1)96.68±4.58 2.89±0.6 22.64±5.04 13.28±5.82模型對照組 85.71±18.48△△ 1.54±0.59△△ 33.09±3.93△△ 5.09±2.07△△阿托伐他汀組 95.35±4.42* 2.21±0.58* 25±4.97＊＊ 10.73±4.08＊＊氨氯地平組 95.56±6.64＊＊ 2.31±0.56＊＊ 23.36±5.05＊＊ 12.06±4.63＊＊冠心平低劑量組 94.1 ±2.41＊＊ 2.09±0.56* 24.27±5.42＊＊ 10.34±4.16＊＊冠心平高劑量組 95.44±4.18＊＊ 2.52±0.76＊＊ 22.09±5.72＊＊ 11.95±5.27正常對照組＊＊

表2 各組3個月小鼠血清ox-LDL的水平 (，n=8)

表2 各組3個月小鼠血清ox-LDL的水平 (，n=8)

注:與正常組比較，△△P﹤0.01;與模型組比較，＊＊P﹤0.01

組 別 劑量/(g·kg－1) ox-LDL(μg/mL)1.24±0.44模型對照組 等量生理鹽水 5.71±1.27△△阿托伐他汀組 6.67×10－3 3.19±1.19＊＊氨氯地平組 1.67×10－3 4.13±0.72＊＊冠心平低劑量組 0.75 5.56±0.93冠心平高劑量組 1.5 2.88±1.12正常對照組 等量生理鹽水＊＊

2.2 冠心平對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型主動脈病理的影響 取主動脈血管用10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于常規病理檢查。HE染色，見圖1～2。

HE染色顯示，正常組血管壁內膜清晰，無斑塊;模型組斑塊嚴重;冠心平組結果與阿托伐他汀組、氨氯地平組的斑塊明顯變小。

3 討論

動脈粥樣硬化 (Atherosclerosis，AS)導致的心肌梗死、腦梗死以及冠心病等心腦血管疾病，在目前人類病死原因中占首位。機體過氧化損傷是動脈粥樣硬化發生發展的重要因素之一。正常情況下，隨著氧化代謝效率的提高，體內的抗氧化能力也不斷增強，人體已經形成較為完善的抗氧化體系，即機體和細胞內活性氧的生成和清除處于一種動態平衡。當在某些因素的作用下這種平衡被打破，就形成了氧化應激。活性氧在血管病變，尤其是動脈粥樣硬化發生發展過程中扮演重要的角色。氧化應激主要通過調節過氧化作用、誘導血管炎癥基因表達、促進局部炎癥反應和細胞增殖，多方面參與動脈粥樣硬化的發生發展。

圖1 冠心平對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型主動脈病理影響

圖2 主動脈動脈粥樣硬化病

人體內SOD以CuZnSOD為主，其含有量最高，是人體細胞抵御氧自由基損害的重要酶。研究證實，氧自由基介導的脂質過氧化損傷參與了動脈粥樣硬化形成和發展的病理過程［3］，氧自由基不僅氧化修飾低密度脂蛋白，促進泡沫細胞形成，而且還可以破壞血管內皮細胞，導致其功能障礙，從而促進動脈粥樣硬化發生。SOD是預防機體形成超氧陰離子自由基損害的主要活性酶，SOD活力增高，可對自由基清除增加，從而減輕對組織的氧化損傷和抑制LDL的氧化。血清中的T-AOC主要是血清中非酶促體系的抗氧化物質和酶促體系少數小分子量抗氧化物質的總和，是反映機體抗氧化作用的重要指標之一［4］。研究發現MDA、T-AOC是自由基損傷和酶促、非酶促系統清除氧自由基作用的敏感指標［5］。GSH是廣泛存在于生物體內的一種生物活性肽，是細胞內重要的還原劑，對過氧化物、自由基和親電子基起拮抗作用，能清除過氧化代謝產物，阻斷脂質過氧化反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用［6］。MDA是脂質過氧化代謝的毒性終產物，其含量直接反映體內脂質過氧化的速率和強度，并可間接反映機體清除自由基的能力，自由基作用于脂質發生過氧化反應，氧化終產物為MDA，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，且具有細胞毒性［7］。ox-LDL促進動脈粥樣硬化形成及進展的機制也非常復雜，例如:ox-LDL作用于血管內皮細胞，誘導其表達ox-LDL，增強其攝取ox-LDL的功能，并可誘導內皮細胞表達基質金屬蛋白酶、纖溶酶原激活物抑制劑-1等炎癥遞質［8］。血漿中低密度脂蛋白(LDL)和自由基代謝產物丙二醛 (MDA)在過氧化作用下，形成氧化修飾的低密度脂蛋白 (OX-LDL)及MDALDL，OX-LDL和MDA-LDL目前被認為是引起細胞內脂質聚集和泡沫形成的重要因素［9-11］。

冠心平由黃精、當歸、三七、瓜蔞皮、甘松組成，具有益氣養陰、活血祛瘀、化痰通絡、行氣止痛之功效。本方源自古方當歸補血湯(《蘭室秘藏》)加減。方中黃精與黃芪既補中益氣，又益精氣，潤心肺，補肝陰，為君藥;當歸養血活血、補中有行、補而不滯，三七活血化瘀通脈，兩味共為臣藥;瓜蔞皮寬胸化痰、開痹散結，為佐藥;甘松理氣止痛，與三七同入心經，可治“卒心腹痛滿”，同為使藥。全方藥物性味平和，攻補兼施，標本兼顧，補而不滯，攻而不峻，藥有側重，甚切冠心病氣陰兩虛、痰瘀互阻之病機。前期臨床研究冠心平能調節血脂水平、保護血管內皮、改善心肌缺血，體外實驗證明冠心平含藥血清能減少細胞上清液中ET、MDA的水平，增加超氧化物歧化酶 (SOD)與一氧化氮合酶 (NOS)的活性，減低細胞凋亡率，減輕細胞線粒體膜電位的增加，降低NF-κB的表達增加?，F代藥理研究發現，黃精、三七、甘松、當歸均具有抗氧化作用［12-14］。

本研究通過實驗證實冠心平對高脂飼料飼喂致動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠，具有升高血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平，和降低血清MDA、ox-LDL水平的作用，證實其確實能夠有效地干預動脈粥樣硬化斑塊發生、發展，降低心血管疾病的發生，為冠心平治療動脈粥樣硬化提供了實驗依據。

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