低劑量γ射線照射后的大鼠血清代謝組學研究

何穎，沈先榮，侯登勇，劉玉明，蔣定文，王慶蓉，李珂嫻，陳偉，錢甜甜

隨著核能技術的發展和廣泛應用，電離輻射的危害越來越受到重視。研究表明，低劑量電離輻射暴露的人群和概率遠大于大劑量照射事件或事故，國內外放射生物學家數十年來一直致力于低水平電離輻射暴露后的生物學效應和健康效應研究，但目前仍然存在較多爭議[1-5]。輻射流行病學調查發現，長期受到低劑量電離輻射的人員會出現頭暈、乏力、記憶力減退等癥狀[6]。電離輻射可誘導機體分子水平的變化，引起代謝產物異常，因此尋找敏感的生物標志物對揭示電離輻射損傷的機制具有重要意義。大劑量電離輻射誘導相關代謝物的變化已有較多研究，但關于低劑量電離輻射對代謝產物的影響鮮見報道[7-10]。代謝組學技術可通過對生物體液、組織中的內源性代謝產物圖片進行分析，研究機體代謝網絡在正常狀態、疾病或藥物作用下的變化規律[11-14]。本研究應用核磁共振(NMR)技術檢測低劑量電離輻射后大鼠血清代謝譜的變化，尋找低劑量電離輻射敏感的生物標志物并探討其損傷機制，為低劑量電離輻射的危害評估和防護提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 INOVA 600MHz超導核磁共振譜儀(Varian Inc.，美國)，配備脈沖場梯度，帶梯度場的三共振探頭。MiniSpin Plus離心機(Eppendorf，德國)。重水(D2O，99.9%，Cambridge Isotope Laboratories Inc.，美國)。3-三甲基硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉(TSP，Merck公司，德國)。

1.2 動物分組與處理 雄性成年SD大鼠16只(購自第二軍醫大學動物中心)，體重200～250g，隨機均分為正常對照組和照射組。照射組采用累積照射法，以60Co γ射線每天照射1h，照射劑量率為72mGy/h，動物距離鈷源中心2.43m。連續照射7d(累積劑量0.5Gy)。正常對照組不進行照射處理。

1.3 血清樣本制備 照射結束后剖殺動物，腹主動脈取血，4℃下3000r/min離心10min，取上清(即為血清)。取1.5ml離心管，向管中依次加入含100μl TSP的重水溶液(1mg/ml)、300 μl血清以及200μl重水(D2O)，充分震蕩混勻后，14 000r/min離心10min，取550μl上清加入5mm核磁共振管中待用。

1.4 NMR數據采集 采用弛豫編輯脈沖序列(CPMG脈沖序列，-RD-90°-(-180°-)n-ACQ)和擴散編輯脈沖序列(LEDbpp脈沖序列，-RD-90°-G1-180°-G1-90 °-T-90°-G1-180 °-G1-90°- -90°-ACQ)采集血清樣本數據，分別觀測血清中的小分子代謝物和脂類代謝產物。CPMG實驗的譜寬為8000Hz，采樣點數64k，采樣時間4s，累加次數64次， τ為200μs，2nτ為320ms，弛豫延遲為2s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。LEDbpp實驗的譜寬為8000Hz，采樣點數64k，采樣時間4s，累加次數64次，擴散時間為100ms，τ為5ms，弛豫延遲為2s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。在對自由感應衰減(free induction decay，FID)信號數據進行填零，分別加上1Hz(CPMG實驗)和3Hz(LEDbpp實驗)的線增寬因子后，進行傅立葉變換，得到核磁共振氫譜(1H NMR)圖。以乳酸甲基信號雙峰的左側峰定標為1.33。

1.5 NMR數據處理 對所得NMR數據經傅立葉變換得到譜圖，然后調整相位并進行基線校正。對CPMG數據，將0.4～4.4范圍內的譜按照每段0.04ppm進行分段積分。對LED數據，將0～6.0范圍內的譜按照每段0.04ppm進行分段積分，并將4.6～5.0之間的譜排除。將積分按每張譜的總積分強度歸一化。

1.6 統計學處理 將檢測所得數據輸入SIMCA-P+軟件(V10.04，Umetrics，Ume，Sweden)進行多元統計分析。數據采用平均中心化(mean centering)或Pareto標度化(Pareto scaling)進行預處理之后采用PCA分析。必要時可對數據采用正交信號校正(orthogonal signal correction，OSC)處理，然后再進行PLS分析。分析結果以得分圖(score plot)和載荷圖(loading plot)的形式表示。

2 結 果

2.1 大鼠血清樣本的1H NMR圖譜 正常對照組和照射組大鼠血清樣本的弛豫編輯和擴散編輯1H NMR譜圖中波峰有明顯差異，提示兩組大鼠血清代謝產物成分有明顯差異(圖1、2)。

2.2 CMPG1H NMR模式識別 正常對照組和照射組大鼠血清樣品的CMPG1H NMR圖譜的正及信號校正－偏最小=乘法(OSC-PLS)分析結果如圖3。模型參數R2X(cum)=89.8%，R2Y(cum)=72.7%，Q2(cum)=64.3%。對應的得分圖(圖3A)的積分值集中分布于散點圖的橢圓內(95%可信區間)，說明模型擬合效果好，兩組的分布區域基本能區分開來。根據載荷圖(圖3B)結合原始圖譜，可以得到差異代謝物及其NMR峰化學位移值，結果顯示，與正常對照組比較，照射組大鼠血清中脂質、葡萄糖、肌酸、甘氨酸/葡萄糖含量增加，乳酸、蘇氨酸/脂質、丙氨酸含量降低(表1)。

2.3 LED1H NMR模式識別 正常對照組和照射組大鼠血清樣品的LED1H NMR圖譜的OSCPLS分析結果如圖4。模型參數R2X(cum)=81.3%，R2Y(cum)=98.2%，Q2(cum)=96.2%。對應的得分圖(圖4A)的積分值集中分布于散點圖的橢圓內(95%可信區間)，說明模型擬合效果好，兩組的分布區域完全分開。根據載荷圖(圖4B)結合原始圖譜，可以得到差異代謝物及其NMR峰化學位移值，結果顯示，與正常對照組比較，照射組大鼠血清中高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白、不飽和脂肪酸含量增加，N-乙酰糖蛋白1、N-乙酰糖蛋白2、飽和脂肪酸和磷脂酰膽堿含量降低(表2)。

圖1 大鼠血清樣本弛豫編輯(CPMG)1H NMR圖譜Fig. 1 1H NMR CPMG spectra of rats serum

圖2 大鼠血清樣本擴散編輯(LED)1H NMR圖譜Fig. 2 1H NMR LED spectra of rats serum

圖3 照射組(■)和正常對照組(▲)大鼠血清1H NMR CPMG的OSC-PLS分析結果Fig. 3 OSC-PLS analysis of serum from irradiated group (■) and control group (▲) based on 1H NMR CPMG spectra

圖4 照射組(■)和正常對照組(▲)血清1H NMR LED的OSC-PLS分析結果Fig. 4 OSC-PLS analysis of serum from irradiated group (■) and control group (▲) based on 1H NMR LED spectra

表1 大鼠血清小分子代謝物濃度變化Tab.1 Change of micromolecular metabolites in rats serum

表2 大鼠血清脂類代謝物濃度變化Tab.2 Changes of lipid metabolites in rats serum

3 討 論

本研究1H NMR模式識別分析發現，正常對照組與低劑量(0.5Gy)γ射線照射組血清代謝物譜存在顯著差異，兩組樣本能較好分開，說明血清代謝組學分析能夠較好地反映低劑量電離輻射對機體產生的生物效應，可作為開展低劑量電離輻射生物效應和分子機制研究的有效手段。

丙氨酸是體內重要的非必需氨基酸，有研究顯示丙氨酸是淋巴細胞再生及免疫過程重要的參與者[15]。N-乙酰糖蛋白是急相反應時血清中檢測到的糖蛋白，其含量變化反映了免疫系統的炎癥反應水平[16-18]。研究發現，輻照后大鼠血清中丙氨酸、N-乙酰糖蛋白含量降低，提示輻射造成了機體的免疫功能受損。

乳酸是糖酵解過程的正常代謝產物，在缺氧條件下在乳酸脫氫酶的催化下由丙酮酸生成，維持機體正常的能量代謝[19]。肌酸是體內細胞能量代謝的中間產物。輻照后乳酸和肌酸含量的變化提示機體能量代謝異常。

磷脂酰膽堿亦稱卵磷脂，在體內可將血液中的膽固醇和脂肪酸乳化為極細的顆粒后從血管中排出，有助于恢復血管彈性、保持血流暢通，被譽為“血管清道夫”。輻照導致大鼠血清中磷脂酰膽堿含量降低，提示機體膽固醇和脂肪酸代謝受損。輻照后脂質、葡萄糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白、不飽和脂肪酸含量增加，飽和脂肪酸含量降低，進一步提示機體糖代謝、脂代謝出現異常。

綜上所述，本研究結果提示，低劑量電離輻射對機體的作用可能與免疫功能受損及能量代謝、糖代謝和脂類代謝異常有關，長期低劑量電離輻射可能危害健康，應采取積極的防護措施，重點關注職業暴露人群的免疫系統功能及代謝類疾病分布情況。

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