多器官功能障礙綜合征小鼠血清多種細胞因子含量變化及其與病程進展的關系

呂藝，劉茜，趙敏，陸江陽

多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是膿毒癥晚期的重要死亡原因，盡管近20年來已有數十種拮抗致炎因子的藥物進入臨床試驗性治療階段，但療效遠不如動物實驗中顯示的效果理想[1-3]，表明上述抗炎措施的靶向性或使用時機還存在偏差[4-5]。本研究采用酵母多糖腹腔注射的方法制作小鼠MODS模型，探討MODS病程發展中血清細胞因子含量的變化規律及其與病情進展的關系。

1 材料與方法

1.1 MODS動物模型制作及分組 6～8周齡健康雄性C57BL/6小鼠165只，體重20～25g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。動物適應性飼養7d，晝夜12h交替，標準飼料喂養，自由飲水，實驗前12h禁食。小鼠隨機分為對照組(n=10)和實驗組(n=155)，實驗組又分為酵母多糖致傷6h(n=15)、12h(n=15)、1d(n=15)、2d(n=30)、5～7d(n=30)、10～12d(n=50)共6個亞組(有效檢測數為10只)。酵母多糖誘導MODS模型的制作參照Jansen等[6]的方法。將酵母多糖粉劑(Sigma，美國)1g與醫用石蠟油40ml混合制成25g/L酵母多糖混懸液，100℃水浴消毒80min，冷卻至室溫，小鼠腹部消毒，腹腔注射酵母多糖懸液(800mg/kg)。常規喂養，觀察死亡率。

1.2 臟器功能檢測 在相應時間點從小鼠眼底動脈取血，肝素抗凝，靜置30min，3000r/min離心15min取血漿，在生化自動分析儀上采用酶動力學法檢測血漿丙氨酸轉氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和肌酸激酶(CK)的活性或濃度。

1.3 血清細胞因子水平檢測 采用ELISA方法測定血清TNF-α、IL-1β、HMGB1、IL-10、IL-12和IL-2濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗進行統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MODS病程不同階段小鼠的癥狀、體征和生存率 實驗鼠注射酵母多糖后3h出現精神不振、活動和進食減少。12h后癥狀逐漸加重，表現為精神萎靡、全身發抖、拒絕飲食、腹瀉、被毛臟濕、不睜眼且分泌物增加，1～2d出現第一個死亡高峰，死亡率為30.1%。2d后，實驗組動物狀態逐漸好轉，動物逐漸恢復基本生活習性，此期間無死亡發生。5～7d時動物再次出現全身癥狀，10～12d時癥狀惡化，出現嗜睡、拒絕飲食及呼吸困難等癥狀，此期出現第二個死亡高峰，死亡率為21.9%。

2.2 酵母多糖致傷對小鼠臟器功能的影響 酵母多糖致傷12h～2d，小鼠血漿ALT、BUN、Cr和CK水平與正常對照組比較均明顯升高(P＜0.05)，至5～7d基本恢復正常，傷后10～12d時，ALT、BUN和Cr值再次升高(P＜0.01，表1)。

表1 酵母多糖致傷小鼠臟器功能變化(±s，n=10)Tab.1 Changes of organ function in zymosan-challenged mice ( , n=10)

表1 酵母多糖致傷小鼠臟器功能變化(±s，n=10)Tab.1 Changes of organ function in zymosan-challenged mice ( , n=10)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with NC group

Group ALT(U/L) BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) CK(U/L)NC group 39.00±16.14 7.72±2.56 42.67±5.79 317.33±206.19 Experiment group 12h-2d 64.92±7.93 (1) 13.03±2.90 (1) 59.30±6.38 (1) 1040.60±362.5 (1)5-7d 46.67±13.45 5.78±1.45 47.33±7.70 602.55±119.64 10-12d 66.40±21.50 (1) 22.55±3.47 (2) 71.67±7.36 (2) 249.60±106.64

2.3 血清細胞因子含量的變化 正常小鼠血清中TNF濃度很低，酵母多糖注射后6～12h血清TNF濃度大幅升高(P＜0.05)，1～5d回降至接近正常水平；10d時再次升高(P＜0.01)，且升高的幅度大于第一次高峰。血清IL-1β含量的變化趨勢與TNF一致，但變化幅度小于TNF。IL-10血清濃度在酵母多糖致傷后6h～2d小幅增加(P＜0.05)，在傷后5d大幅增加(P＜0.01)，傷后10d仍維持在高水平。HMGB1血清濃度在致傷后逐漸增加，傷后1～2d達峰值，隨后一直維持在較高水平。酵母多糖致傷早期血清IL-2濃度未發生明顯改變，傷后1～2d明顯降低，5d、10d時進一步降低，僅為對照組及傷后早期的1/3。血清中IL-12濃度在傷后1～2d后逐漸降低，傷后10d時僅為對照組的1/2(P＜0.01，圖1)。

3 討 論

圖1 小鼠血清細胞因子含量的變化Fig.1 Changes of serum level of cytokines in rats

膿毒癥早期，患者表現出以“細胞因子瀑布”為特征的過度炎癥反應[1,7-8]，臨床治療手段的進步使多數患者能夠度過這一階段而存活[9-10]。然而，生存者后續發生的非致病菌院內感染及潛在病毒激活往往會加重病情導致死亡[9,11]。動物實驗及臨床觀察均發現，膿毒癥/MODS病程發展經歷了由早期過度炎癥反應狀態逐步發展為后期顯著的免疫抑制的過程[7,12-15]。由此設想，在膿毒癥病程發展過程中，機體損傷及抗損傷力量的不斷變化，使針對早期過度炎癥反應的防治措施與MODS病程進展階段不匹配，從而導致抗炎治療失敗甚至加重損傷[16]。因此，對于膿毒癥的防治，除了針對病程早期的過度炎癥反應和晚期的免疫麻痹狀態采取相應的措施外，還應進一步認識膿毒癥病情由免疫活化向免疫抑制轉變的機制及其過程中的免疫學特點，在病情尚未進入免疫麻痹階段發現時異常并進行干預，這將有助于降低MODS的病死率。

本研究采用酵母多糖腹腔注射誘發小鼠MODS模型[17]，免疫活化/紊亂為關鍵的致病因素，發病特征與MODS的臨床病程進展較為相似[18-19]。在病程發展過程中，血清中多種致炎、抗炎細胞因子含量的變化呈現出早期免疫活化為主、晚期免疫耐受占優勢的特征，并與動物的臟器功能損傷及早、晚兩個死亡高峰期吻合[20]。結果表明，酵母多糖誘發的MODS，其病程發展的不同階段病理機制不同。

以往多種針對膿毒癥及MODS發病早期炎癥介質釋放“瀑布效應”的臨床治療手段失敗的教訓提示我們，根據病程不同階段免疫紊亂的特征來選擇干預靶標是有效防治MODS的前提[1-5]。為此，我們從不同角度選擇了多種細胞因子，包括早期致炎因子TNF和IL-1，晚期炎癥因子HMGB1、抑炎因子IL-10，以及T細胞活化相關因子IL-2和抗原呈遞細胞活性相關因子IL-12[17,21-22]。通過觀察血清中這些因子的濃度變化，分析機體在MODS病程不同階段的免疫學特征。結果發現，在MODS病程進展中這些因子的血清濃度變化呈現序貫性：早期炎癥因子TNF和IL-1在酵母多糖致傷后的急性損傷期(6～12h)大幅升高后回落，隨即在傷后1～2d HMGB1含量增加，5d后IL-10含量大幅增加，而IL-2和IL-12自傷后1～2d起逐漸降低。結合癥狀、體征、臟器功能變化及死亡發生高峰可以看出，在病程早期，血清中炎癥介質濃度的改變以致炎因子升高為特征；在病程晚期，血清致炎因子TNF和IL-1、晚期炎癥因子HMGB1和抑制性因子IL-10同時大幅升高，而T細胞和抗原提呈細胞源性的細胞因子IL-2和IL-12大幅減少。血清中炎癥介質的變化特點清晰地反映出機體的免疫功能由過度炎癥反應(免疫活化)轉化為免疫抑制和活化共存的狀態，并與脾臟DC在病程中的免疫活性變化特征一致[23]。

值得注意的是，血清致炎因子TNF和IL-1的高峰出現在病程早期第一個死亡高峰期之前(酵母多糖致傷后6～12h)，在死亡高峰的1～2d時兩種致炎因子均已接近正常對照值，對應的是血清膿毒癥晚期介質HMGB1含量的大幅增加。據此認為，拮抗TNF和IL-1的措施應在傷后6～12h實施，而在傷后1～2d則應采取抗HMGB1的策略，以此降低動物在病程早期的死亡發生率。

本研究中另一個值得重視的現象是，在病程的緩解期(動物無死亡發生)，血清HMGB1和IL-10濃度大幅升高，而IL-2和IL-12濃度降低。其中，HMGB1具有免疫抑制效應[24]，IL-10可抑制抗原提呈細胞(APC)上共刺激分子的表達[25]，從而抑制細胞免疫應答；兩者的升高與血清中反映T細胞和抗原提呈細胞活性的IL-2和IL-12的減少相吻合，呈現出典型的免疫抑制的血清學特征，提示緩解期機體致炎反應的減輕并不意味著病情的好轉，很可能是轉向免疫抑制的潛在信號。而在病程晚期的免疫抑制狀況下，致炎因子TNF和IL-1的再次大幅增加提示機體很可能受到內源性菌群移位或條件致病菌感染的打擊，這可能是臨床上部分度過早期過度炎癥反應的生存者最終沒有逃脫死亡命運的原因[26]。因此，密切關注血清致炎和抗炎因子含量的變化可以及早地發現病情發展中機體出現的免疫抑制征象，從而及時地進行干預，阻止病情惡化。晚期血清學指標顯示出免疫活化與免疫耐受共存的特點，提示在治療上應采取免疫調節的策略。

綜上所述，在酵母多糖腹腔注射誘發的小鼠MODS的發生和發展過程中，血清中多種致炎/抗炎細胞因子含量變化呈現出早期免疫活化為主、晚期免疫耐受占優勢的特征，并與病情進展密切相關；動態觀察血清細胞因子含量的變化有助于判斷機體免疫狀態從過度活化向耐受的轉化，對及時、有效地干預病情具有重要的理論意義和臨床應用價值。

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