再灌注前干預肥大細胞功能對大鼠腸缺血再灌注后早期肝損傷的影響*

黃品婕， 李曉蕓， 羅晨芳， 張璦蘭， 劉健培

(中山大學附屬第三醫(yī)院1麻醉科，2胃腸外科，廣東廣州510630)

腸缺血再灌注(intestinal ischemia-reperfusion，IIR)除引起腸道損傷外，還是全身炎癥反應和多器官衰竭發(fā)生的重要原因［1-2］。由于接受來自腸道的雙重血液供應，肝臟是腸缺血再灌注最先受累的遠隔臟器，而其本身具有巨大的內(nèi)皮細胞和單核巨噬細胞庫，可能成為失控炎癥反應過程中多種炎癥介質(zhì)的源泉［3-4］。腸缺血再灌注后可能會導致急性肝功能障礙［3］。目前研究證明氧化應激、炎癥介質(zhì)的激活及失控性釋放等是腸缺血再灌注損傷的重要機制之一［5-6］，大多數(shù)學者認為腸源性內(nèi)毒素血癥是腸缺血再灌注致遠隔器官損傷的主要原因，但由于腸源性毒性物質(zhì)眾多，腸缺血再灌注引起繼發(fā)性早期肝損傷的具體發(fā)生機制目前仍不明確。

肥大細胞廣泛分布于全身結締組織中，尤以皮膚、呼吸道、消化道黏膜下層結締組織中居多，正常情況下肥大細胞很少分布于人/鼠類肝臟，而在肝硬化晚期肝臟中可見肥大細胞數(shù)目急劇增加［7］。肥大細胞受刺激時，以胞吐方式大量釋放顆粒內(nèi)的物質(zhì)(常稱為脫顆粒)，主要介質(zhì)包括組胺、類胰蛋白酶、類糜蛋白酶、肝素和細胞因子等，在病理狀態(tài)下產(chǎn)生廣泛的生物學效應。組胺是由肥大細胞脫顆粒釋放的胺類物質(zhì)，通過與組胺受體結合參與過敏、炎癥反應、調(diào)節(jié)機體免疫功能、促進胃酸分泌、維持內(nèi)皮功能等。Kalia等［8］通過腸缺血前3 d連續(xù)經(jīng)胃灌注組胺拮抗劑酮替酚，可提高大鼠再灌注后生存率。Zhao等［9］的研究表明，可通過核因子E2相關因子2-抗氧化反應元件(nuclear factor E2-related factor 2-antioxidant response element，Nrf2-ARE)信號通路增強抗氧化能力，從而減輕腸缺血再灌注導致的繼發(fā)性肝損傷。Cámara-Lemarroy等［10］報道抑制腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)表達和脂質(zhì)過氧化反應可能對腸缺血再灌注后腸道、肺和肝損傷具有保護作用。

以肥大細胞為靶點防治腸缺血再灌注后腸、肺損傷已有報道，并證明了抑制肥大細胞脫顆粒能減輕腸缺血再灌注損傷，但這些處理對繼發(fā)性早期肝損傷的影響尚不明確。本研究的主要目的是通過藥物干預肥大細胞功能，觀察色甘酸鈉(肥大細胞膜穩(wěn)定劑)、酮替酚(組胺H1受體拮抗劑)和compound 48/80(肥大細胞脫顆粒劑)于腸缺血后再灌注前靜脈應用對腸缺血再灌注繼發(fā)性肝損傷的影響，并從肝臟功能性和病理性改變、血清組胺水平、肝細胞因子的變化、氧化應激和炎癥反應等方面探討肥大細胞在腸缺血再灌注致早期肝損傷中的可能機制，以及分析血漿肝功能水平與組胺、肝細胞因子及氧化指標的關系，為肥大細胞為靶點的藥物治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

色甘酸鈉(ICN Pharmaceuticals)，酮替酚和compound 48/80(Sigma)，TNF-α、白細胞介素 8(interleukin-8，IL-8)和組胺 ELISA試劑盒(R＆D)，BCA組織總蛋白提取試劑盒(凱基生物公司)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性試劑盒(南京建成生物工程公司)。

2 動物與分組

中山大學實驗動物中心提供的35只清潔級雄性SD大鼠，體重180～270 g。按基礎飼料飼養(yǎng)1周，室溫25～27℃，適應環(huán)境后，按體重隨機分為5組，每組7 只:假手術(sham operation，S)組、IR 組、IR+C組(缺血再灌注+色甘酸鈉25 mg/kg)、IR+K組(缺血再灌注+酮替芬1 mg/kg)和IR+CP組(缺血再灌注+compound 48/80 0.75 mg/kg)。色甘酸鈉、酮替芬和compound 48/80劑量參照我們以往的研究所用劑量［8，11-12］。

3 動物模型建立

模型建立參照我們以往研究，5組大鼠均于術前16 h禁食，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉后，仰臥位固定，消毒鋪巾，腹部正中切口進腹，分離腸系膜上動脈。S組只分離腸系膜上動脈，不阻斷;其余4組用無損傷動脈夾夾閉腸系膜上動脈根部，75 min后松開動脈夾，模型復制成功的標準為缺血處腸系膜微動脈搏動消失;且再灌注前腸道淤黑、腫脹;動脈夾松開后缺血處腸系膜微動脈恢復搏動。IR+C、IR+K和IR+CP組分別在再灌注前5 min經(jīng)尾靜脈注射色甘酸鈉、酮替芬或compound 48/80;S和IR組分別給予等量生理鹽水。然后縫合腹膜、肌肉和皮膚，放于37℃恒溫箱保溫，自由飲水。

4 主要方法

4.1 標本處理 分別在再灌注4 h時斷頭處死各組大鼠，動物處死后立即取肝左內(nèi)側葉用10%甲醛固定，用于光鏡病理觀察。肝右葉標本冷生理鹽水沖洗，裝入凍存管液氮快速冰凍，－80℃保存?zhèn)溆谩８谓M織150 mg制作組織勻漿，以4 000 r/min離心15 min，取上清液以BCA法測定組織總蛋白濃度。同時，動物處死后立即取2 mL下腔靜脈血，分離血漿取上清液放于－70℃冰凍保存。

4.2 血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotrans-ferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)和組胺水平檢測 血清 ALT和AST的檢測使用全自動生化分析儀，單位以U/L表示。采用ELISA試劑盒測定大鼠血清組胺濃度。按試劑盒操作說明進行。

4.3 肝組織病理學損傷的評價 采用盲法在光鏡下觀察其病理學變化，每個標本隨機取5個視野取平均值作為每個標本的評分值。肝組織損傷分級和評分采用如下標準［13］:0分:肝小葉、肝細胞、肝細胞索、中央靜脈、肝竇均正常;1分:少見肝細胞變性，匯管區(qū)少量炎癥細胞聚集;2分:肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血，散在肝細胞變性、壞死，肝組織內(nèi)炎癥細胞聚集較多，肝小葉結構完整;3分:肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血，廣泛肝細胞變性、壞死，大量炎癥細胞聚集，部分肝小葉破壞不完整。

4.4 肝組織LDH活性檢測 采用組織全LDH活性試劑盒測定肝組織LDH活性。按試劑盒操作說明進行。

4.5 肝組織TNF-α和IL-8濃度檢測 采用ELISA試劑盒測定大鼠肝組織勻漿TNF-α和IL-8濃度。按試劑盒操作說明進行。

4.6 肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測 采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。按照操作程序分別在測定管、對照管加入對應的試劑及樣品，混勻，置37℃恒溫水浴40 min，加入顯色劑，混勻，室溫放置10 min，于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。根據(jù)吸光度值算出肝組織勻漿中SOD活力。采用硫代巴比妥酸反應法測定MDA含量。按照操作程序分別在標準管、標準空白管、測定管、測定空白管加入對應的試劑和樣品，混勻，95℃水浴40 min，取出后流水冷卻，然后3 500～4 000 r/min離心10 min。取上清1 mL，532 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。根據(jù)吸光度值算出肝組織勻漿中MDA含量。

5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件處理。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用SNK法進行組間的兩兩比較。血漿組胺水平、肝TNF-α、IL-8、MDA濃度、SOD活性與血漿AST水平的關系采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 一般資料

各組大鼠的體重、體表面積等一般情況無顯著差別(P ＞0.05)。

2 血清ALT、AST、組胺水平

與S組相比，其余各組的血清ALT和AST水平明顯升高(P＜0.05);與IR組相比，IR+C和IR+K組的血清ALT和AST水平明顯降低(P＜0.05)，IR+CP組的血清 ALT和 AST水平明顯增高(P＜0.05)，見圖1A、B。

與S組相比，各組的血清組胺濃度明顯升高(P＜0.05);與IR組相比，IR+C和IR+K組的血清組胺濃度明顯降低(P＜0.05)，IR+CP組的血清組胺含量明顯增高(P＜0.05)，見圖1C。

Figure 1.The levels of ALT(A)，AST(B)and histamine(C)in serum after IR injury.Mean±SD.n=7.*P＜0.05 vs S group;#P ＜0.05 vs IR group.圖1 腸缺血再灌注后血清ALT、AST、組胺濃度變化

3 肝組織光鏡病理改變

光學顯微鏡觀察可見，S組肝細胞排列整齊，胞漿染色均勻，肝血竇清晰且無明顯擴張，匯管區(qū)結構正常;IR組和IR+CP組表現(xiàn)肝細胞腫脹，胞漿淡染，肝血竇不規(guī)則有少量充血，匯管區(qū)血管充血、擴張;而IR+C和IR+K組與IR組相比，表現(xiàn)為肝細胞腫脹明顯減輕，胞漿染色較勻，肝細胞的排列較整齊，肝血竇清楚，匯管區(qū)血管充血、擴張明顯減輕。

病理形態(tài)學積分，與S組相比，各組的病理評分明顯增加(P＜0.05);與IR組相比，IR+C和IR+K組的病理評分降低(P＜0.05)，而IR+CP組的病理評分增加(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Morphological changes of liver tissues and liver histological score under light microscope after IR injury(HE staining，×400).A:sham;B:IR;C:IR+C;D:IR+K;E:IR+CP.Mean±SD.n=7.*P ＜0.05 vs S group;#P ＜0.05 vs IR group.圖2 腸缺血再灌注后肝臟形態(tài)學及組織學評分改變

4 肝組織TNF-α和IL-8含量測定結果

與S組相比，其余各組的TNF-α和IL-8濃度明顯升高(P＜0.05);與IR組相比，IR+CP組的肝組織TNF-α和IL-8濃度明顯升高(P＜0.05)，而 IR+C、IR+K組的肝組織TNF-α和IL-8濃度明顯降低(P ＜0.05)，見圖 3A、B。

5 肝組織MDA含量和SOD活性變化

與S組相比，各組的肝組織MDA濃度明顯升高，SOD活性降低(P＜0.05);與IR組相比，IR+C和IR+K組的肝組織MDA濃度明顯降低，SOD活性升高(P＜0.05)，IR+CP組的肝組織MDA含量明顯增高，SOD 活性降低(P ＜0.05)，見圖3C、D。

6 肝組織LDH活性檢測結果

與S組相比，各組的肝組織LDH活性明顯升高(P＜0.05);與IR組相比，IR+C和IR+K組的肝組織LDH活性明顯降低(P＜0.05)，IR+CP組的肝組織LDH活性明顯升高(P＜0.05)，見圖3E。

7 血清 AST與血清組胺、肝 TNF-α、IL-8、MDA、SOD水平的相關分析

血清AST水平與血清組胺水平呈正相關(r=0.757，P＜0.01)，與肝組織 TNF-α含量呈正相關(r=0.893，P ＜0.01)，與肝組織 IL-8 含量呈正相關(r=0.859，P ＜0.01)，與肝組織 MDA 含量呈正相關(r=0.836，P ＜0.01)，與肝組織 SOD 活性呈負相關(r= －0.793，P ＜0.01)。

討 論

在腸、肺、心臟和腦缺血再灌注損傷的研究中，以肥大細胞為靶點進行干預減輕缺血再灌注損傷取得了一定效果，證實有可能是一種有前景的方法［8，14-16］。早期在急性胰腺炎引起繼發(fā)性肺損傷的研究中，應用肥大細胞膜穩(wěn)定劑色甘酸鈉干預肥大細胞功能，也證實肥大細胞可能通過增加中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞的細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達來促進白細胞的活化，啟動遠隔器官損傷［17］。我們的前期研究證明了缺血后給予色甘酸鈉、酮替芬能減輕腸缺血再灌注損傷，提高動物存活率;而使用肥大細胞脫顆粒劑compound 48/80則加重腸缺血再灌注損傷，使動物存活率降低［12］。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)腸缺血再灌注后肝臟出現(xiàn)繼發(fā)性損傷，伴隨血清ALT、AST水平和肝臟LDH活性升高，給予色甘酸鈉、酮替芬能減輕肝臟病理性及功能性損傷，使用compound 48/80則加重肝損傷。提示腸缺血后給予色甘酸鈉、酮替芬能減輕再灌注后肝臟早期損傷，使用肥大細胞脫顆粒劑compound 48/80則起相反作用。

Figure 3.The levels of TNF-α (A)，IL-8(B)MDA(C)，SOD(D)and LDH(E)in liver tissues after IR injury.Mean±SD.n=7.*P ＜0.05 vs S group;#P ＜0.05 vs IR group.圖3 腸缺血再灌注后肝組織 IL-8、TNF-α、MDA、SOD及LDH水平的變化

組胺是肥大細胞釋放的主要活性物質(zhì)之一，能增加血管通透性，誘導炎癥細胞浸潤，刺激上皮細胞釋放細胞因子，引起或加重組織損傷，同時能進一步誘發(fā)肥大細胞活化。組胺拮抗劑被廣泛應用于缺血再灌注的保護，有學者報道通過腸缺血前3 d連續(xù)經(jīng)胃灌注酮替酚可提高大鼠生存率［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)腸缺血再灌注后血清組胺含量增高，給予色甘酸鈉、酮替芬處理后血清組胺含量減少，而使用compound 48/80則增加組胺含量。同時相關分析結果表明血清組胺含量與血清AST水平呈正相關。以上結果提示腸缺血再灌注后腸源性肥大細胞被激活，并釋放大量活性物質(zhì)進入血液系統(tǒng)，其中組胺可能是造成遠隔器官肝臟損傷的原因之一。

腸缺血后再灌注肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)的毒性物質(zhì)及腸道組織缺氧產(chǎn)生的反應性氧化中介因子可以誘導肝臟的氧化損傷［9］。有研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞可加重氧化損傷，肥大細胞激活促進細胞內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生，促使 SOD活性降低，MDA水平增高［18］。我們的研究顯示應用色甘酸鈉抑制肥大細胞脫顆粒、應用酮替芬拮抗組胺效應，均可升高肝臟SOD活性，減少肝臟MDA水平，減輕肝臟早期氧化損傷;而compound 48/80促進肥大細胞脫顆粒，可加重肝氧化損傷。相關分析顯示血清AST含量與肝臟MDA水平呈正相關，與肝臟SOD活性呈負相關。以上表明肥大細胞介導的氧化應激可能參與了腸缺血再灌注后早期肝損傷過程。

炎癥介質(zhì)的激活是引發(fā)遠隔臟器損傷機制中極為關鍵的環(huán)節(jié)。研究表明，腸缺血再灌注后內(nèi)毒素易位誘導肝臟內(nèi) IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生，組織病理切片可觀察到出血、水腫和炎癥細胞浸潤，血清ALT、AST水平明顯增加［4］。本研究結果發(fā)現(xiàn)使用色甘酸鈉或酮替芬后肝TNF-α和IL-8水平顯著降低;而compound 48/80組TNF-α和IL-8水平顯著增高，提示抑制肥大細胞脫顆粒或拮抗組胺效應，均可減輕腸缺血再灌注肝臟炎癥反應，相反促進肥大細胞脫顆粒則加重肝臟炎癥反應。相關分析顯示血清AST含量與肝TNF-α和IL-8水平呈正相關。這些結果表明肥大細胞激活參與了促炎因子的生成，可能也是肥大細胞引起腸缺血再灌注致早期肝損傷的機制之一。

總之，本研究結果首次表明干預肥大細胞功能可以影響大鼠腸缺血再灌注導致的肝損傷情況。再灌注前抑制肥大細胞功能，減少組胺釋放可以減輕腸缺血再灌注后肝臟早期氧化損傷和炎癥反應從而減輕肝臟損傷。而促進肥大細胞脫顆粒則加重肝損傷。關于腸缺血再灌注后早期肝損傷的具體機制還有待進一步研究。

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