5-ALA表面修飾TiO2誘導的光動力療法體外滅活HL60細胞實驗研究＊

林柏瀚，陳 麗，洪旭亮，肖 化，艾保全，熊建文*

(1.華南師范大學物理與電信工程學院，廣東廣州 510006;2.廣東工業大學物理與光電工程學院，廣東廣州 510006)

光動力療法作為一種臨床治療癌癥的方法，具有靶向性好(僅將光敏劑周圍的病變細胞作為目標)以及對病患傷害小的優點，因此被廣泛地應用于腫瘤的治療［1］。在光動力療法中，光敏劑吸收特定波長的光，將能量轉移到分子氧，進而產生一系列的活性氧，起到滅活癌細胞的作用［2］。5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)屬于有機酸類，是生物合成光敏劑原卟啉IX(PPIX)的前體物，是臨床上應用最廣泛的光敏藥物，基于5-ALA的PDT(ALA-PDT)已成功用于膀胱癌、皮膚癌和食道癌等癌癥的治療［3］。然而，如何提高其對白血病腫瘤細胞的滅殺靈敏度，以及應對多類型的癌癥仍然是ALA-PDT所迫切需要解決的問題。

最近幾年，二氧化鈦(TiO2)憑借良好的生物相容性、環境友好性以及對腫瘤細胞的選擇性，TiO2開始成為一種潛在的光敏劑，應用于PDT研究中［4-7］。在紫外光波輻照下，TiO2表面產生光生空穴-電子對，光生空穴能夠跟溶液中的水或者羥基反應，生成活性氧，從而誘導滅活癌細胞［8，9］。研究表明，利用TiO2表面獨特的物理和化學性質，通過羧基(-COOH)與TiO2表面羥基(-OH)的鍵合，可將一些帶有羧基的染料分子或者有機酸類包覆在TiO2的表面，提高 TiO2光電轉化效率，光催化效率和分散性［10-14］。因此，本文將帶有羧基的5-ALA包覆在TiO2納米顆粒的表面，并使用傅里葉紅外光、拉曼光譜以及紫外-可見光吸收光譜對制備的樣品進行了表征，利用相襯顯微鏡對PDT作用前后的細胞進行細胞無損形態學觀察。我們的目的在于利用TiO2的運載作用提高PDT靶向作用，從而達到提高5-ALA體外滅活HL60細胞的效率，并對5-ALA/TiO2體外滅活HL60細胞作用機理作了初步探討。

1 材料與方法

1.1 細胞株

HL60細胞株，由中山大學實驗動物中心細胞庫提供。

1.2 試劑與儀器

TiO2(P25，德國 DEGUSSA)，5-ALA(上海先輝醫藥)，CCK-8試劑(日本同仁化學研究所)，RPMI-1640培養基(美國Gibco)，傅立葉紅外光譜儀(美國Nicolet 6700)，激光顯微拉曼光譜儀(香港Renishaw雷尼紹)，超聲儀器(上海科導)，U-3010紫外可見光度計(日本日立)，相襯顯微鏡(天津拓普儀器)，XDS-1A倒置顯微鏡(廣州光學儀器)，自動細胞計數器(美國Invitrogen)，LPE-1A激光功率能量計(北京物科光電)，PDT反應室(自行設計)，SW-CJ型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術)，HH.CP-TW80升二氧化碳培養箱(上海一恒科技)，DG5031型酶聯免疫檢測儀(南京華東電子)，96孔培養板，6孔培養板，細胞計數板及其他常規器皿，403 nm光源(自行設計)。

1.3 實驗方法

1.3.1 5-ALA表面修飾的二氧化鈦納米顆粒(5-ALA-TiO2)的制備 在暗室條件下，稱量2.62 mg的5-ALA和3.2 mg的TiO2，分散于裝有5mL超純水的玻璃試管中，密封并震蕩搖勻，TiO2懸浮于溶液中，隨后將試管置于超聲加熱器中，40℃超聲處理4 h，使材料充分反應。5-ALA和TiO2的混合摩爾比例為:1∶2。作為對比，在相同的條件下制備TiO2和5-ALA樣品。

1.3.2 細胞培養 HL60細胞培養在胎牛血清含量10%的 RPMI-1640培養基，并置于 37℃，5%CO2，95%空氣濕度的培養箱中培養，取指數生長期的細胞進行實驗。

1.3.3 細胞活性檢測 采用與傳統的細胞活性檢測方法MTT法相比，操作方便、簡潔、靈敏度高、重復性好的 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法［15，16］，以 490 nm為測量波長，630 nm為參比波長對細胞進行活性檢測，降低實驗誤差。

2 實驗結果與討論

2.1 樣品光譜分析

2.1.1 傅里葉紅外光譜與拉曼光譜分析 在樣品中，TiO2納米粒子與5-ALA分子可能的結合方式主要為兩種，一種為普通的物理附著，一種為化學結合。圖1為TiO2和5-ALA/TiO2傅里葉紅外光譜。圖1(A)為純TiO2的譜線，3350 cm-1附近為TiO2表面羥基峰，圖1(B)為表面包覆了5-ALA的TiO2的譜線，由圖可見，在1430 cm-1附近和1730 cm-1附近出現了羧酸酯(-COOTi-)特征峰，這說明，5-ALA與TiO2表面活性較高的羥基發生了類似于羧酸和醇生成脂的反應。此外，圖1(B)中可觀察到3350 cm-1附近的羥基峰相對圖1(A)對應峰有所減弱，這是因為5-ALA與TiO2表面的羥基反應，消耗了部分羥基，導致3350 cm-1處的峰減弱，這進一步說明兩者確實發生反應。該反應可寫成:

這表明5-ALA與TiO2通過羧基以及羥基的鍵合成功的結合，而不是普通的物理附著。這一點在圖2得到了驗證，5-ALA/TiO2的拉曼光譜中1423 cm-1附近和1728 cm-1可以很清楚地觀察到羧酸酯(-COOTi-)的特征峰。

2.1.2 紫外可見光光譜分析 圖3是純TiO2以及5-ALA/TiO2的紫外可見光吸收光譜。5-ALA與TiO2二者結合之后對TiO2在可見光范圍吸收的影響較為明顯，也進一步說明二者之間結合緊密。圖中，純TiO2在400 nm附近的吸收較弱，當5-ALA結合在TiO2表面時，樣品在400 nm附近的吸收明顯增強。樣品在可見光范圍吸收增強，能夠提升樣品在可見光照射下的光催化活性，于是在一定程度上提高樣品滅活癌細胞的效率。

以上分析說明了制備的樣品中5-ALA與TiO2結合緊密，并且在可見光范圍吸收增強，可作為一種新型的光敏藥物用于后續的細胞滅活實驗。

2.2 5-ALA/TiO2介導的 PDT體外滅活 HL60細胞實驗

圖1 TiO2和5-ALA/TiO2傅里葉紅外光譜Fig.1 The FTIR spectra of TiO2and 5-ALA/TiO2

圖2 5-ALA/TiO2的拉曼光譜Fig.2 Raman spectra of 5-ALA/TiO2

圖3 TiO2和5-ALA/TiO2的吸收光譜Fig.3 The absorption spectrum of TiO2and 5-ALA/TiO2

圖4 各實驗組OD值與PDT效率Fig.4 OD value and PDT efficiency of different groups

將對數生長期HL60細胞接種于2塊96孔培養板中，編號分別為A、B，每塊培養板劃分為4組，分別為 Control組、TiO2組、ALA組、5-ALA/TiO2組。B板置于培養箱中培養24小時后，ALA組加適量的ALA，使培養液中ALA的終值濃度為1 mmol/L;TiO2組加適量的TiO2，使培養液中 TiO2的終值濃度為160μg/mL;5-ALA/TiO2組加適量制備好的摩爾比為1∶2的5-ALA/TiO2，使培養液中5-ALA終值濃度為1 mmol/L、TiO2終值濃度為2 mmol/L(160μg/mL)。放回培養箱中繼續培養;B板放培養箱中培養24小時后接受光照(光功率5 mW/cm2，光劑量18 J/cm2，光波長403±6 nm)，然后放回培養箱中繼續培養24小時;A板置于培養箱中培養48小時，不光照。每個實驗條件設3個復孔，每孔總體積200μL，細胞接種濃度1×105個/mL。采用CCK-8法進行細胞活性檢測。得出各組的OD值如圖4(A)。

由圖4(A)可知，在無光照情況下，5-ALA、TiO2、5-ALA/TiO2組細胞的OD值相對于各自對應的無光照細胞組的OD值無明顯變化，這表明各組樣品對細胞沒有暗毒性;光照后，各Without radiation組細胞的OD值均高于Radiation組細胞的OD值，此外在5-ALA/TiO2作用下接受光輻照后的細胞相對成活率要低于TiO2或5-ALA單獨作用下接受光輻照后細胞的相對成活率。圖4可知，5-ALA/TiO2的滅活效率相對于5-ALA和TiO2有明顯提高，達到了77.9%。

結合前面的光譜分析，滅活效率提高的可能機理是:首先5-ALA分子與TiO2納米顆粒結合緊密，PDT實驗中TiO2納米顆粒作為藥物載體，5-ALA易于集中作用，在小區域范圍內5-ALA濃度增大，轉化和聚集的PpIX增多，另外在TiO2納米顆粒的牽引下，更多的5-ALA進入細胞內，提高5-ALA的利用率，從而提高滅殺效率;其次TiO2納米顆粒吸收了較短波長的光以后被激發，并將能量轉移至5-ALA，光能利用效率加大，從而提高了對HL60細胞的滅殺效率。

2.3 相襯顯微鏡細胞形態學無損觀研究

2.3.1 相襯顯微鏡細胞形態學無損觀察 利用相襯顯微鏡觀察5-ALA/TiO2作用過程中細胞形態變化，相比掃描電鏡，相襯顯微鏡觀測是一種對細胞無損的觀察方法，無需對細胞進行前期固定處理，幾乎不影響細胞，保持細胞原始狀態，利于我們初步探討5-ALA/TiO2滅活細胞的機理。圖5(A)以及圖5(E)均為PDT作用前的細胞，此時的細胞飽滿，輪廓清晰，與周圍環境有明顯的界限，由于細胞表面平整光滑，整個細胞在視場中較為明亮。當光照15分鐘時，由圖5(B)可知此時的細胞邊緣開始模糊，細胞膜出現褶皺，此時細胞在視場中較為暗淡，這表明所制備藥物在光能的激發下開始與細胞膜發生作用。圖5(C)光照時間30分鐘后的表面，此時細胞在視場中與圖5(B)中細胞一致，較為模糊暗淡，然而此時的細胞膜開始出現破裂(圖中左上角處)，并且在破裂處可以看到細胞內物質外流，這說明了所制備的藥物能夠有效地破壞細胞膜。光照1小時后，圖5(D)顯示細胞萎縮變形，部分成碎片。對比圖5(A)和圖5(F)可知，PDT作用后，視場內的細胞明顯減少，只剩余少數細胞殘骸，其形貌與圖5(D)一致。

圖5 PDT作用前后的細胞形態學觀察(A:作用前的細胞;B:作用15分鐘的細胞;C:作用30分鐘的細胞;D:作用1小時的細胞;E:作用前細胞;F:作用后的細胞)Fig.5 The morphology of untreated and treated HL60 cells(A:The untreated cells;B:Cells treated by 15 minutes PDT;C:Cells treated by 30 minutes PDT;D:Cells treated by 1 hour PDT;E:The untreated cells;F:The treated cells)

2.3.2 藥物作用機理探討 以上觀察表明，隨著光照時間的增加，即光劑量的增加，藥物對光子吸收越多，與周圍環境作用產生的活性氧越多，于是對細胞的破壞能力就越強。相襯顯微鏡細胞形態學無損觀察表明，5-ALA/TiO2對細胞的部分作用靶點首先是細胞膜，藥物通過與細胞膜接觸并在光子激發下釋放活性氧，誘導細胞膜破裂，隨后細胞內部營養物質以及一部分細胞器流失，從而誘導細胞凋亡。相襯顯微鏡細胞形態學觀察進一步表明，制備的藥物能夠有效抑制細胞生長。此外，在幾幅圖片中都可以看到細胞內有一些細小的斑點，這有可能是進入細胞內部的部分納米粒子。

圖6 激光顯微拉曼光譜檢測圖(A:HL60細胞拉曼光譜;B:加入TiO2培養24 h的HL60細胞)(附圖為TiO2的拉曼光譜)Fig.6 The Micro Raman spectroscopy picture(A:The Micro Raman spectroscopy picture of HL60 cells，B:The Micro Raman spectroscopy picture of HL60 cells cultured with TiO2for 24 h)(The attached picture is the Micro Raman spectroscopy picture of TiO2)

2.3.3 激光顯微拉曼光譜儀檢測細胞內納米粒子 圖6(A)是HL60細胞激光顯微拉曼光譜檢測圖，6(B)是與適當濃度TiO2一起培養24 h的HL60細胞的檢測圖。實驗中，我們將激光光斑聚焦在細胞上(圖6上圖)，得到細胞的拉曼光譜(圖6下圖)。由圖A可知，HL60細胞的拉曼光譜在波數120 cm-1附近出現較強的峰，波數 1303.7 cm-1，1333.4 cm-1，1452.3 cm-1和 1665.9 cm-1出現峰。圖 B 顯示，與TiO2一起培養的HL60細胞拉曼光譜在圖6(A)對應波數處附近均出現峰并在波數144.5 cm-1出現新峰，在波數 393.4 cm-1，514.2 cm-1和 638.3 cm-1位置微隆起，對比純TiO2的拉曼光譜(圖B虛線圖)，可知此時的HL60細胞內存在TiO2納米粒子。對比A、B兩圖可知，細胞對應峰以及TiO2對應峰的位置均發生不同程度的偏移，并且B圖的峰強度得到了增強，這表明，加入TiO2納米粒子以后，TiO2納米粒子與HL60細胞發生一定的相互作用。以上分析可知，TiO2納米粒子在與細胞一起培養的過程中，能夠進入細胞，并與細胞發生一定的相互作用。

3 結論

我們將傳統光敏劑5-ALA與TiO2結合，利用傅里葉紅外光譜、拉曼光譜以及吸收光譜對制備的樣品進行表征，結果表明5-ALA與TiO2結合緊密且5-ALA提高了TiO2在可見光范圍的吸收;在5-ALA/TiO2介導的PDT體外滅活HL60細胞實驗研究中，由于TiO2納米粒子使5-ALA相對集中，提高了靶向性;5-ALA與TiO2之間的能量交換提高了光能利用率，提高了細胞滅活效率;此外，利用相襯顯微鏡對PDT過程中細胞形態學變化進行無損觀察，初步探討了5-ALA/TiO2誘導細胞凋亡的機制，結果顯示藥物首先與細胞膜發生作用，隨著輻照時間的增加，藥物對細胞膜破壞更加明顯，導致細胞膜破裂，胞內營養物質流失，最終誘導細胞凋亡，PDT滅活效率達到77.9%，而激光顯微拉曼光譜檢測表明TiO2能夠進入細胞內部，并與細胞發生相互作用。至于5-ALA/TiO2在細胞中的精確定位，及其對細胞內部的具體作用機制我們將在后續的實驗研究中探討。實驗最終表明，通過表面修飾法制備的5-ALA/TiO2能夠有效抑制HL60細胞生長，是治療白血病的一種潛在的光敏劑。

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