基于磷脂脂肪酸提取方法的微生物群落結構研究

摘要：選取川西高原土壤和凋落物作為研究對象，分別取1、3、5、8、10 g土壤和0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g凋落物用于PLFA（磷脂脂肪酸）的提取。經試驗確定，土壤和凋落物用于PLFA提取的最佳提取量分別為8 g和1.0 g，用超聲波提取替代振蕩提取，縮短了PLFA方法的提取時間。進一步分析土壤和凋落物中微生物群落結構信息，結果表明，相同環境下土壤和凋落物中大部分微生物類群的種類和含量都十分接近，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更有優勢，厭氧菌比好養菌更加活躍。

關鍵詞：土壤；凋落物；PLFA（磷脂脂肪酸）；微生物群落結構

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0323-03

收稿日期：2013-10-30

基金項目：國家自然科學基金 （編號：31170916 ）；中國科學院儀器設備功能開發技術創新項目（編號：yg20110708）。

作者簡介：李范（1988—），男，四川自貢人，碩士研究生，主要研究方向為土壤微生物。E-mail：554063409@qq.com。

通信作者：李萍，博士，教授，碩士生導師。E-mail：wuping4535@sina.com。 土壤和凋落物中存在極其豐富的微生物，它們直接影響著土壤的結構、肥力以及養分轉化等，通過磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）方法可以對微生物群落進行定量分析。本研究首次采用超聲波方法提取森林土壤及凋落物中PLFA，探討各提取條件得到的PLFA含量差異，并分析森林土壤和凋落物間微生物群落結構及其相互作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗土壤與凋落物均取自中國科學院茂縣山地生態系統定位研究站，地理坐標（31°41′N，103°53′ E），屬暖溫帶亞高山季風氣候，冬季寒冷干燥、夏季多雨，土壤pH值為5.8～60，年平均溫度為8.9 ℃，年降水量919.5 mm。取表層0～20 cm 土壤并混勻，過2 mm篩，去掉石塊植物殘根等雜物，裝入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱運回實驗室，于-70 ℃保存，7 d內完成PLFA測定。

凋落物收集于分解試驗開始前半年進行，樣方內均勻設置凋落物收集框，框的大小為2 m（長）×2 m（寬）×20 cm（高），底部安裝有孔徑為8 mm的尼龍網。收集時間為1個季度，將收集到的凋落物樣品去除網內雜物，將枝葉以枝與葉的重量比為1 ∶1的比例混合均勻，將收集到的凋落物放入分解袋，再將分解袋放置在采樣地表周圍，本次試驗采用的塑料網袋為20（長） cm×20（寬） cm、網眼為1 mm，并在下一季度取回，低溫保存帶回實驗室，測重后將凋落物碾碎進行磷脂脂肪酸分析。

1.2試驗方法

為了確定土壤跟凋落物中PLFA的最適提取量，土壤分別取1、3、5、8、10 g，凋落物分別取0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g用于PLFA的提取，加入足量的提取劑 （25 mL），保證不同樣品量的凋落物和土壤都能得到充分的提取，進而確定各自最佳取樣量。

為了確定提取方法對提取效率的影響，同時為了驗證超聲波提取樣品中的PLFA能否在傳統振蕩提取的基礎上用更短的時間提出PLFA，本試驗采用有機質含量較高的黑土作為研究對象，具體方法為：第1次提取，振蕩時間設120 min，超聲時間分別設20、30、40、50、60 min，第2次提取方法與第1次提取方法相同，提取時間分別減半。用2次提取的PLFA總含量來衡量提取效率。

從-70 ℃的冰箱中取出經冷凍干燥的土壤及掉落物，用氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液（ 體積比為1：2：0.8）作提取劑振蕩提取脂類[1]，再用100 μL 25 mg/L的C19做內標溶解氮吹干的脂肪酸甲酯，通過帶有MIDI峰識別軟件的Agilent N6850氣相色譜進行分析。

2試驗結果

2.1土壤中PLFA含量的分析

在3 g土壤中檢測得到的單體PLFA數為24個，而在8 g土壤中則增加到了29個，10 g土壤中單體PLFA的數量比 3 g 土壤中多6個，在土壤小于8 g時，檢測到的PLFA數量隨著土壤量的增加而增加（表1）endprint

摘要：選取川西高原土壤和凋落物作為研究對象，分別取1、3、5、8、10 g土壤和0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g凋落物用于PLFA（磷脂脂肪酸）的提取。經試驗確定，土壤和凋落物用于PLFA提取的最佳提取量分別為8 g和1.0 g，用超聲波提取替代振蕩提取，縮短了PLFA方法的提取時間。進一步分析土壤和凋落物中微生物群落結構信息，結果表明，相同環境下土壤和凋落物中大部分微生物類群的種類和含量都十分接近，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更有優勢，厭氧菌比好養菌更加活躍。

關鍵詞：土壤；凋落物；PLFA（磷脂脂肪酸）；微生物群落結構

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0323-03

收稿日期：2013-10-30

基金項目：國家自然科學基金 （編號：31170916 ）；中國科學院儀器設備功能開發技術創新項目（編號：yg20110708）。

作者簡介：李范（1988—），男，四川自貢人，碩士研究生，主要研究方向為土壤微生物。E-mail：554063409@qq.com。

通信作者：李萍，博士，教授，碩士生導師。E-mail：wuping4535@sina.com。 土壤和凋落物中存在極其豐富的微生物，它們直接影響著土壤的結構、肥力以及養分轉化等，通過磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）方法可以對微生物群落進行定量分析。本研究首次采用超聲波方法提取森林土壤及凋落物中PLFA，探討各提取條件得到的PLFA含量差異，并分析森林土壤和凋落物間微生物群落結構及其相互作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗土壤與凋落物均取自中國科學院茂縣山地生態系統定位研究站，地理坐標（31°41′N，103°53′ E），屬暖溫帶亞高山季風氣候，冬季寒冷干燥、夏季多雨，土壤pH值為5.8～60，年平均溫度為8.9 ℃，年降水量919.5 mm。取表層0～20 cm 土壤并混勻，過2 mm篩，去掉石塊植物殘根等雜物，裝入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱運回實驗室，于-70 ℃保存，7 d內完成PLFA測定。

凋落物收集于分解試驗開始前半年進行，樣方內均勻設置凋落物收集框，框的大小為2 m（長）×2 m（寬）×20 cm（高），底部安裝有孔徑為8 mm的尼龍網。收集時間為1個季度，將收集到的凋落物樣品去除網內雜物，將枝葉以枝與葉的重量比為1 ∶1的比例混合均勻，將收集到的凋落物放入分解袋，再將分解袋放置在采樣地表周圍，本次試驗采用的塑料網袋為20（長） cm×20（寬） cm、網眼為1 mm，并在下一季度取回，低溫保存帶回實驗室，測重后將凋落物碾碎進行磷脂脂肪酸分析。

1.2試驗方法

為了確定土壤跟凋落物中PLFA的最適提取量，土壤分別取1、3、5、8、10 g，凋落物分別取0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g用于PLFA的提取，加入足量的提取劑 （25 mL），保證不同樣品量的凋落物和土壤都能得到充分的提取，進而確定各自最佳取樣量。

為了確定提取方法對提取效率的影響，同時為了驗證超聲波提取樣品中的PLFA能否在傳統振蕩提取的基礎上用更短的時間提出PLFA，本試驗采用有機質含量較高的黑土作為研究對象，具體方法為：第1次提取，振蕩時間設120 min，超聲時間分別設20、30、40、50、60 min，第2次提取方法與第1次提取方法相同，提取時間分別減半。用2次提取的PLFA總含量來衡量提取效率。

從-70 ℃的冰箱中取出經冷凍干燥的土壤及掉落物，用氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液（ 體積比為1：2：0.8）作提取劑振蕩提取脂類[1]，再用100 μL 25 mg/L的C19做內標溶解氮吹干的脂肪酸甲酯，通過帶有MIDI峰識別軟件的Agilent N6850氣相色譜進行分析。

2試驗結果

2.1土壤中PLFA含量的分析

在3 g土壤中檢測得到的單體PLFA數為24個，而在8 g土壤中則增加到了29個，10 g土壤中單體PLFA的數量比 3 g 土壤中多6個，在土壤小于8 g時，檢測到的PLFA數量隨著土壤量的增加而增加（表1）endprint

摘要：選取川西高原土壤和凋落物作為研究對象，分別取1、3、5、8、10 g土壤和0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g凋落物用于PLFA（磷脂脂肪酸）的提取。經試驗確定，土壤和凋落物用于PLFA提取的最佳提取量分別為8 g和1.0 g，用超聲波提取替代振蕩提取，縮短了PLFA方法的提取時間。進一步分析土壤和凋落物中微生物群落結構信息，結果表明，相同環境下土壤和凋落物中大部分微生物類群的種類和含量都十分接近，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更有優勢，厭氧菌比好養菌更加活躍。

關鍵詞：土壤；凋落物；PLFA（磷脂脂肪酸）；微生物群落結構

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0323-03

收稿日期：2013-10-30

基金項目：國家自然科學基金 （編號：31170916 ）；中國科學院儀器設備功能開發技術創新項目（編號：yg20110708）。

作者簡介：李范（1988—），男，四川自貢人，碩士研究生，主要研究方向為土壤微生物。E-mail：554063409@qq.com。

通信作者：李萍，博士，教授，碩士生導師。E-mail：wuping4535@sina.com。 土壤和凋落物中存在極其豐富的微生物，它們直接影響著土壤的結構、肥力以及養分轉化等，通過磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）方法可以對微生物群落進行定量分析。本研究首次采用超聲波方法提取森林土壤及凋落物中PLFA，探討各提取條件得到的PLFA含量差異，并分析森林土壤和凋落物間微生物群落結構及其相互作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗土壤與凋落物均取自中國科學院茂縣山地生態系統定位研究站，地理坐標（31°41′N，103°53′ E），屬暖溫帶亞高山季風氣候，冬季寒冷干燥、夏季多雨，土壤pH值為5.8～60，年平均溫度為8.9 ℃，年降水量919.5 mm。取表層0～20 cm 土壤并混勻，過2 mm篩，去掉石塊植物殘根等雜物，裝入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱運回實驗室，于-70 ℃保存，7 d內完成PLFA測定。

凋落物收集于分解試驗開始前半年進行，樣方內均勻設置凋落物收集框，框的大小為2 m（長）×2 m（寬）×20 cm（高），底部安裝有孔徑為8 mm的尼龍網。收集時間為1個季度，將收集到的凋落物樣品去除網內雜物，將枝葉以枝與葉的重量比為1 ∶1的比例混合均勻，將收集到的凋落物放入分解袋，再將分解袋放置在采樣地表周圍，本次試驗采用的塑料網袋為20（長） cm×20（寬） cm、網眼為1 mm，并在下一季度取回，低溫保存帶回實驗室，測重后將凋落物碾碎進行磷脂脂肪酸分析。

1.2試驗方法

為了確定土壤跟凋落物中PLFA的最適提取量，土壤分別取1、3、5、8、10 g，凋落物分別取0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g用于PLFA的提取，加入足量的提取劑 （25 mL），保證不同樣品量的凋落物和土壤都能得到充分的提取，進而確定各自最佳取樣量。

為了確定提取方法對提取效率的影響，同時為了驗證超聲波提取樣品中的PLFA能否在傳統振蕩提取的基礎上用更短的時間提出PLFA，本試驗采用有機質含量較高的黑土作為研究對象，具體方法為：第1次提取，振蕩時間設120 min，超聲時間分別設20、30、40、50、60 min，第2次提取方法與第1次提取方法相同，提取時間分別減半。用2次提取的PLFA總含量來衡量提取效率。

從-70 ℃的冰箱中取出經冷凍干燥的土壤及掉落物，用氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液（ 體積比為1：2：0.8）作提取劑振蕩提取脂類[1]，再用100 μL 25 mg/L的C19做內標溶解氮吹干的脂肪酸甲酯，通過帶有MIDI峰識別軟件的Agilent N6850氣相色譜進行分析。

2試驗結果

2.1土壤中PLFA含量的分析

在3 g土壤中檢測得到的單體PLFA數為24個，而在8 g土壤中則增加到了29個，10 g土壤中單體PLFA的數量比 3 g 土壤中多6個，在土壤小于8 g時，檢測到的PLFA數量隨著土壤量的增加而增加（表1）endprint