白藜蘆醇對AD大鼠學習記憶能力和海馬P-tau表達的影響

王景方， 伊紅麗， 袁曉玲， 劉力峰， 夏章勇， 郭存舉

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的非黃酮類多酚類化合物，其結構與合成的雌激素類化合物己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)類似，與雌激素受體有較高的親和力，被認為是一種植物雌激素［1］，并能防止雌激素替代治療出現的嚴重副作用。研究發現Res對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)小鼠認知功能具有一定保護作用，并能改善AD小鼠的抗氧化能力［2］。目前，關于Res對 AD動物模型的干預作用機制報道很少，本實驗以Aβ誘導制備AD大鼠模型，給予AD大鼠白藜蘆醇，觀察大鼠學習記憶能力的改變及海馬組織形態學變化、P-tau表達的變化，探討白藜蘆醇改善AD大鼠學習記憶功能的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用雄性清潔級SD大鼠50只，體重170～210 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，合格證號0001406。置于室溫25±2℃，12/12 h晝夜循環光照條件下生活，自由攝食、飲水。

1.1.2 藥品與試劑 Res(陜西慈緣生物技術有限公司，純度 99%，批號 030120)，Aβ25～35(Sigma公司，批號109K5794)，兔抗Tau多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號20120612)。

1.1.3 儀器 雙臂數字式腦立體定位儀(德國艾德儀器公司，型號68004)，OLYMPUS生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號BX45)，Image-Pro Plus 5.1圖像處理軟件。

1.2 方 法

1.2.1 模型制備 大鼠用 10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頭頂部正中切口暴露前囟，參照大鼠腦立體定位圖譜［3］，以前囟為原點，向后 4.4 mm，旁開 2.2 mm為穿刺點，顱鉆穿孔，自顱骨表面進針3.0 mm至雙側海馬，用微量注射泵將1μl(10μg)Aβ25～35在5 min內緩慢注入，留針5 min，以使Aβ25～35充分浸潤局部組織，假手術組注射等量的生理鹽水。退針后縫合傷口，縫合前撒少許青霉素鈉粉末，縫合后用碘酒消毒，術后腹腔注射青霉素鈉防止感染，連續3 d。常規飼養。

1.2.2 動物分組及給藥 大鼠隨機分為5組:假手術組、AD模型組、Res(高、中、低劑量)治療組，每組10只。造模3 d后，Res治療組分別灌胃給予88 mg/(kg·d)，44 mg/(kg·d)，22 mg/(kg·d)，連續21 d。假手術組和模型組灌胃等量的三蒸水連續21 d。

1.2.3 水迷宮實驗觀察大鼠學習記憶能力術后12 d進行通道式水迷宮訓練，上、下午各訓練1次，共7 d。訓練時選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄各大鼠進入盲端次數和到達終點所需時間，訓練期間水溫在(25±2)℃，迷宮外參照物保持一致。將各組7 d的成績進行比較。

1.2.4 取材 各組大鼠灌胃21 d后，10%水合氯醛(300mg/kg)，腹腔注射麻醉，快速剪開胸廓，捏住心臟，于心尖處剪一小口，插入灌注針頭到主動脈，止血鉗固定，剪開右心耳，快速滴入氯化鈉150 ml，再注入4%多聚甲醛300 ml，取腦，浸入固定液中，待用。

1.2.5 免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(Streptavidin-Perosidase，SP)法檢測海馬P-tau蛋白的表達 3%H2O2室溫孵育10 min滅活內源性過氧化物酶;0.01 mol/L PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液(pH為6.0)微波熱修復抗原;滴加一抗(1:500)，37℃水浴箱孵育40 min;滴加辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase，HRP)標記的免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)抗體，37℃水浴箱孵育20 min;二氨基聯苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)顯色;放入自來水中終止顯色，蘇木精輕度復染，脫水，封片。每張切片在顯微鏡下隨機取4個高倍視野觀察海馬 CA1、CA2、CA3、CA4區域并拍照。神經元胞質及突起內染棕黃色為P-tau陽性表達，采用Image-ProPlus5.1圖像處理軟件統計積分光密度(Itegral Optical Density，IOD)。

1.2.6 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色觀察大鼠海馬組織形態結構變化 按照HE染色的步驟進行染色，光學顯微鏡觀察海馬組織形態學變化并拍照。

1.2.7 統計學方法 采用 SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量數據以χ±s表示，統計采用單因素方差分析，多組樣本均數之間兩兩比較采用LSD分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對AD模型大鼠學習記憶能力的影響動物在水迷宮游出時間越短，錯誤次數越少反映動物學習記憶能力越強。與假手術組相比，模型組大鼠游出時間和錯誤次數明顯增加(P＜0.01)，與模型組相比，Res高劑量組和中劑量組大鼠游出時間和錯誤次數明顯下降(P＜0.05)(見表1)。

2.2 白藜蘆醇對AD大鼠海馬組織形態結構變化的影響 各組大鼠海馬組織神經元變化:假手術組大鼠海馬組織神經細胞著色均勻為淺藍紫色，排列緊密，胞核完整，核仁深染;模型組大鼠海馬組織神經細胞層數和數量減少，細胞間隙變大，排列紊亂，部分細胞體積縮小，細胞核固縮，并有破裂，整個細胞深染成紅色;高、中劑量組神經細胞著色均勻，排列較緊密;低劑量組神經元胞質濃染，數量較模型組增多(見圖1)。

2.3 各組大鼠海馬組織P-tau的表達 假手術組大鼠海馬組織P-tau未見明顯表達;模型組大鼠海馬組織P-tau表達呈強陽性;Res高劑量組大鼠海馬組織P-tau表達不明顯;中劑量組大鼠海馬組織P-tau表達輕度;低劑量組大鼠海馬組織P-tau表達中度(見圖2)。與假手術組比較，模型組大鼠海馬內P-tau積分光密度(IOD)明顯增加(P＜0.01);與模型組比較，Res高、中劑量組大鼠海馬內P-tau積分光密度明顯降低(P＜0.01)(見表2)。

圖2 各組大鼠海馬組織P-tau的表達(免疫組化SP法，×400)

表1 白藜蘆醇對AD大鼠學習記憶能力的影響(χ±s)

表2 白藜蘆醇對AD大鼠海馬組織P-tau表達的影響(χ±s)

3 討論

AD是慢性進行性中樞神經系統變性病導致的癡呆，以漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經精神癥狀為特征。病理改變主要為皮質彌漫性萎縮、溝回增寬、腦室擴大、神經元大量減少，并可見老年斑(Senile plaque，SP)、神經原纖維纏結(Neurofibrillary tangles，NFT)等病變［4］。AD發病機制復雜，當前研究關于AD的發病機制主要有微管相關蛋白異常學說、淀粉樣肽假說、膽堿能損傷學說、基因突變學說、內分泌失調學說、炎癥反應等。在微管相關蛋白異常學說中，NFT是AD的主要損傷，是由神經元纖維異常聚集形成。AD中主要的纖維結構是雙股螺旋纖維，其核心的主要成分為微管相關蛋白的tau蛋白，tau蛋白是一種分布在中樞神經系統內的低分子量含磷糖蛋白，它可以與神經軸突內的微管結合，并且具有誘導與促進微管蛋白聚合成微管、防止微管解聚和維持微管功能的穩定的作用。當tau蛋白發生高度磷酸化，這使tau蛋白喪失同微管的結合能力，破壞了細胞骨架系統的穩態，同時導致自身的聚集而形成雙股螺旋纖維。過度磷酸化tau(P-tau)蛋白是NFT的主要成分，臨床病理研究發現AD患者的癡呆癥狀嚴重程度與腦組織中NFT數量呈正相關，提示tau蛋白過度磷酸化與 AD 發病相關［5，6］。

白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結和血管舒張，保持血液暢通，具有抗動脈粥樣硬化和冠心病，調節血脂及抗低密度脂蛋白氧化的作用，還具有雌激素樣作用。本實驗結果顯示:與假手術組相比，模型組大鼠游出時間、錯誤次數以及海馬內P-tau積分光密度均明顯增加，且海馬組織神經細胞層數和數量減少;與模型組相比，Res高劑量組和中劑量組大鼠游出時間、錯誤次數以及海馬內P-tau積分光密度均明顯降低，且海馬神經細胞著色均勻，排列較緊密。研究揭示白藜蘆醇可改善AD大鼠的學習記憶能力，減少海馬神經元丟失，其作用可能是通過降低海馬P-tau的表達，從而減少老年斑和神經纖維纏結實現的。不論給予高、中、低劑量的Res均可改善AD大鼠的學習、記憶能力，且有明顯的量效關系。總之，本研究為Res在雌激素替代治療AD中的作用提供了實驗依據，為進一步尋找有效措施，充分降低P-tau的蛋白表達，最終改善學習和記憶的能力提供新的思路。本研究不足主要為樣本量太小，有待于擴大樣本及相關檢測指標以進一步探討。

［1］張學景，鄒 永，鐘榮清，等.白藜蘆醇的雌激素樣作用及其治療的相關意義［J］.中國新藥雜志，2004，13(8):692-695.

［2］林 茂，萬 章，王春梅.白藜蘆醇對阿爾茨海默病小鼠記憶和抗氧化能力的影響［J］.現代中西醫結合雜志，2009，18(5):484-486.

［3］Paxinos G，Watson C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.San Diego［M］，CA:Academic，1997.1-79.

［4］王維治.神經病學［M］.北京:人民衛生出版社，2008.1397-1400.

［5］蔡 標，申國明，汪遠金，等.大豆異黃酮對AD大鼠海馬Apo-E4的影響［J］.遼寧中醫藥大學學報，2011，13(7):117-119.

［6］魯遠君，余昌胤.阿爾茨海默病中針對tau蛋白治療的研究進展［J］.中國神經免疫學和神經病學雜志，2008，15(3):211.