去鐵酮對大鼠腦出血后三價鐵轉運體及神經功能的影響

尹永鋒， 王改青， 陳艷麗

鐵離子是腦出血后血紅蛋白的降解產物，可增強氧化應激、促進脂質過氧化、損傷DNA和蛋白質，在腦水腫形成、繼發性腦損害中起關鍵作用［1，2］。目前對腦出血的實驗干預多采用去鐵胺［3～5］，經胃腸吸收差，不能口服，而本實驗采用分子量更小、親脂性高、血腦屏障透過率更好的去鐵酮［6］，以減少藥物不能及時到達病灶、發揮最大療效對實驗的影響。去鐵酮是口服的鐵螯合劑，可特異性的結合三價鐵，促進其從體內排出［6］。目前國內外關于去鐵酮干預腦出血后三價鐵相關轉運體變化的研究報道較少。本實驗旨在觀察去鐵酮干預大鼠腦出血后鐵蛋白(Ft)、轉鐵蛋白(Tf)和轉鐵蛋白受體(TfR)的表達變化及神經功能障礙的動態變化。

1 材料與方法

1.1 模型制備 選擇健康成年SD大鼠72只，雌雄各半，體重250～300 g，隨機分為假手術對照組(SH)、腦出血組(ICH)、去鐵酮組(DFP)，每組再分1 d、3 d、7 d、14 d 4 個亞組，每亞組6 只。采用大鼠Ⅳ型膠原酶(美國sigma)定位注射制造腦出血模型。大鼠稱重后以10%水合氯醛按300 mg/kg體重腹腔注射麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀(WDT-V型，中國產)，使大鼠前后囟位于同一水平面，備皮、消毒、暴露前囟，于前囟右側旁開3.2 mm，前囟后1.2 mm處用骨鉆鉆一直徑約1 mm的小孔，用微量泵及微量注射器(上海高鴿)取配好的2.5 μl含0.5 UⅣ型膠原酶的溶液，于5 min注射于蒼白球(前囟后 1.2 mm 右側旁開 3.2 mm，深 5.6 mm)，注射完畢后留針15 min緩慢退出，無菌骨蠟封閉圓孔，縫合皮膚后消毒。SH組步驟相同，注入等量生理鹽水。術后24 h按Rosenberg評分法大于10分或斷頭取腦證實有血腫者入選實驗［7］。未到各預定時間點死亡者或到時間點斷頭取腦未見血腫者剔除實驗，重新造模補足實驗數量。DFP組于術后24 h Dfp(加拿大奧貝泰克)灌胃125 mg/kg/次，1次/12 h(Q12 h)，SH組與ICH組術后24 h給予等量的生理鹽水灌胃Q12 h。

1.2 神經功能評分 各組大鼠造模后正常飲食，按預定時間點根據Rosenberg評分法［7］進行評分。

1.3 免疫組化染色 應用兔抗Ft、Tf、TFR多克隆抗體(武漢博士德，稀釋比例1:150)、SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德)。將石蠟標本切片常規脫蠟入水，用新鮮配制的3%H2O2液處理10 min，PBS洗5 min，3次，切片浸入0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)，電磁爐加熱至沸騰后斷電，冷卻至室溫后，PBS洗3次，加山羊血清封閉液(武漢博士德)，室溫20 min，甩去多余液體，滴加一抗，37℃孵育2 h;PBS洗5 min，3次;加生物素標記的羊抗兔IgG(武漢博士德)，37 ℃孵育30 min，PBS 洗5 min，3 次;加 SABC，37℃孵育30 min，PBS洗5 min，3次;DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明、封片。光學顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，包括正態性檢驗、方差齊性檢驗、LSD多重比較檢驗、Dunnett’s T3多重比較檢驗，數據均采用均數 ±標準差(χ±s)表示，顯著性水平 α =0.05。

2 結果

2.1 神經功能評分 與SH組比，ICH組、DFP組各時間點均增高，ICH組以1 d最高，3 d、7 d與1 d比差異無統計學意義，于14 d有所下降，DFP組以1 d、3 d最高，之后逐漸下降，于14 d仍高于SH組，DFP組與同時間點ICH組比差異無統計學意義(見表1)。

2.2 Ft免疫組化 SH組比，ICH組Ft免疫陽性細胞數于1 d無明顯變化，于3 d、7、14 d增多，以7 d最多;DFP組Ft免疫陽性細胞數也于3 d、7 d、14 d增多，變化趨勢相同，但增幅較ICH組小(見表2)。鏡下顯示Ft陽性細胞主要表達于血腫周圍的神經元、神經膠質細胞胞質中。

2.3 Tf免疫組化 與SH組比較，ICH組Tf免疫陽性細胞數于 1 d、3 d、7 d、14 d 增多，以 3 d 最多，7 d次之;DFP組Tf免疫陽性細胞數也于各時間點增高，但升高程度均低于ICH組(見表3)。鏡下顯示Tf陽性細胞多見于血腫周圍少突膠質細胞胞漿或胞核內。

2.4 TfR免疫組化 與SH比較，ICH組 TfR免疫陽性細胞數于1 d天開始增高，3 d、7 d達高峰，于14 d降至對照組水平;DFP組變化趨勢與之相同，但各時間點表達量均比ICH組少(見表4)。鏡下顯示TfR陽性細胞主要表達于血腫周圍的神經元和脈絡叢內皮細胞胞膜和胞漿。χ±s)

表1 不同組別、不同時間點大鼠神經功能評分(n=6，χ±s，單位:分)

表2 不同組別、不同時間點血腫周圍Ft免疫陽性細胞數(n=6，χ±s)

表3 不同組別、不同時間點血腫周圍Tf免疫陽性細胞數(n=6，χ±s)

表4 不同組別、不同時間點血腫周圍TfR免疫陽性細胞數(n=6，

3 討論

正常情況下，體內鐵在Ft、Tf、Tfr等作用下處于生理穩態，發揮其生理作用［8，9］。腦出血后腦組織內鐵離子大量聚集參與了早期的腦損傷，可導致后期神經系統變性［3，10～12］，故對鐵離子的有效清除是改善預后重要的手段之一。Dfp是三價鐵螯合劑，鞏泉泉［6］等發現去鐵酮在大鼠腦和睪丸中均可測出，說明其穿透力極強，可通過血腦屏障，有利于對腦組織內鐵離子的有效清除。

腦組織將超過生理需要的鐵以Ft的形式儲存于神經元內，避免過多的鐵離子對自身組織的損害。研究表明［3，10］:Tf-Tfr通路是鐵通過毛細血管內皮的主要通路。本實驗顯示ICH組Ft主要表達于血腫周圍的神經元細胞中，于3 d開始升高，7 d達高峰，到14 d仍高于正常;而Tf主要表達于血腫周圍的少突膠質細胞中，Tfr主要表達于血腫周圍的神經元和脈絡叢細胞中，兩者均從1 d開始升高，3～7 d達高峰，后逐漸下降。可以推斷腦出血后大量鐵離子的產生破壞了機體原有的鐵平衡狀態，機體為維持自身平衡而激活Fe-Tf-TfR通路，促進鐵離子的外排，另一方面將其轉變為Ft儲存起來。Zhang、Jing等發現腦出血后有從腦跨過血腦屏障進入血液的Tf，提示 Tf、TfR 可 能 參 與 鐵 超 載 的 清 除［13，14］。Jimin Wu［10］等發現Ft的上調是由鐵介導的，腦出血后Ft、Tf、TfR的上調有可能起神經保護作用。

Dfp干預腦出血后，F、Tf、TfR的表達量較ICH組雖有所下降，但仍遠遠高于SH組，提示Dfp可能通過及時有效的結合三價鐵減輕了機體的鐵負荷，進而減輕了自身誘發維持鐵平衡機制的力度，但DFP組的神經功能評分與同時間點ICH組比并無改善。鐵主要通過Fenton反應產生活性氧激發氧化壓力，引起組織脂質過氧化、蛋白質氧化及DNA的破壞［15，16］。Fenton 反 應:Fe2++H2O2→ Fe3++OH-+OH-，腦出血后二價鐵是主要蓄積形式。其原因可能是Dfp有效的結合Fe3+使其減少，促進了該反應的進行，導致活性氧的形成增加從而抵消了清除Fe3+而帶來的益處。Auriat、Warkentin 等人［4，5］的研究也表明三價鐵螯合劑可降低總鐵含量但不能改善神經功能障礙。

此外，在實驗之初，Dfp劑量為400 mg/kg/次，大鼠在干預1 d即開始出現血尿、鼻腔出血、精神萎靡，3 d左右相繼死亡，改為200 mg/kg/次，上述癥狀稍有改觀，但仍于5 d左右相繼死亡，改為125 mg/kg/次后尚能完成實驗。由此可見，Dfp的毒性過大限制了其使用劑量。本實驗大鼠的神經功能評分未能改善也許有一部分原因可歸咎于藥物使用劑量偏少。

總之，Dfp可降低腦出血后Ft、Tf、TfR表達上調的程度，不能改善神經功能障礙，而腦出血后自身Ft、Tf、TfR的表達上調可能起神經保護作用。使用二價鐵螯合劑也許可以在清除鐵超載的同時不促進Fenton反應進行以減少活性氧的產生，這也許是改善腦出血預后的一個新的研究方向。

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